[发明专利]固氮斯氏假单胞菌A1501 rpoN基因的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的rpoN基因的表达方法，尤其涉及利用衣藻叶绿体表达系统表达斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的方法，属于固氮斯氏假单胞菌A1501 rpoN基因的表达领域。

背景技术

氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是自然界中动物、植物、微生物不可缺少的生命元素。氮素在自然界有多种存在形式，数量最大的是大气中的氮气占大气体积的79％，总量约3.9×107亿吨，但是不能为大多数生物(包括所有植物和动物)直接利用，因此氨态氮的供应成为生物界繁荣发展的主要决定因素。目前，固氮主要有以下两种方式，即工业固氮和生物固氮。工业固氮指用高温、高压、化学催化的方法；生物固氮是指某些种类的原核生物利用体内的固氮酶将空气中的氮气还原为氨，为植物生长提供氮素。

人类对于生物固氮的认识要追溯到十九世纪，距今已有100多年的历史。最早在1830年，Boussingault报道豆科植物可以固氮。Hellriegel & Wilfarth于1886年报道并于1888年发表关于豆科植物能够固氮的可靠依据，并且确定了豆科植物的根瘤是固氮的主要场所。随后不久，厌氧的Clostridium pasteurianum，好养的Azotobacter chroococcum，以及cyanobacteria，photosynthetic bacteria，Klebsiella spp.，Archaebacteria，Desulfovibrio sp.，等都加入到固氮的行列。到目前为止，随着研究的不断深入，发现自然界中可进行生物固氮的微生物种属范围分布比较广，可以分成自生固氮、共生固氮和联合共生固氮3种。

生物固氮主要依靠多数原核生物，这些原核生物之所以能够固氮，是因为固氮酶的缘故。固氮酶是一种复杂的金属酶，由钼铁蛋白和铁蛋白组成(或称为组分I和组分II，也有称之为Dinitrogenase和Dinitrogenase reductant)。固氮作用是一个复杂的过程，其调节是在转录水平上实现的，主要是根据环境中氧气的含量和铵的水平进行调控的。

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的rpoN基因在斯氏假单胞菌A1501的固氮调节作用中起着非常重要的作用。RNA聚合酶需要依靠σ⁵⁴(rpoN基因的产物)才能启动主要nif基因簇的转录，因此才能保证某些原核生物的固氮作用。

为了深入的研究固氮斯氏假单胞菌的固氮作用机理以及rpoN蛋白的功能、特性及纯化方式等，需要有大量的rpoN蛋白作为物质基础。因此，提供一种稳定、高效的表达rpoN基因的方法能够为固氮斯氏假单胞菌的固氮调节作用机制以及rpoN蛋白的功能、特性及纯化方式等研究奠定物质基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种固氮斯氏假单胞菌A1501的rpoN基因的表达方法，该方法以衣藻叶绿体为表达系统，能够稳定、高效的在衣藻叶绿体中表达rpoN基因。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的rpoN基因的表达方法，包括：构建rpoN基因的表达盒；将所构建的rpoN基因的表达盒插入到衣藻叶绿体表达载体上的衣藻叶绿体基因组的同源片段之间，构建得到重组衣藻叶绿体表达载体；将重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻；筛选转基因衣藻，诱导转基因衣藻中的rpoN基因表达，收获并纯化所表达的蛋白。

其中，所述的斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；

所述的rpoN基因的表达盒由衣藻叶绿体特异启动子、rpoN基因和衣藻叶绿体特异终止子所组成，其中，rpoN基因置于衣藻叶绿体基因特异启动子和终止子的调控之下；所述的衣藻叶绿体特异启动子包括但不限于atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL，优选为atpA启动子；所述的衣藻叶绿体特异终止子优选为rbcL终止子。

所述的衣藻叶绿体基因组的同源片段为trnE2-psbH基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；