[发明专利]一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医药提取技术领域，特别是涉及一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂。

背景技术

蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90％至95％。酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。就眼镜蛇蛇毒而言，含有细胞毒素(Cytotoxin，CTX)、神经毒素(neurotoxin，NT)，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)和多种酶类等。神经毒素(neurotoxin，NT)在蛇毒中含量较高，一般在20％～50％之间，毒性极强，是该类毒蛇咬伤致死的主要成分之一。

蛇毒神经毒素种类多、活性强、性质稳定、结构相对简单，因此一直备受人们的关注。近年来随着生化技术的发展及分子生物学方法的应用，已经从不同的蛇毒中分离纯化出许多的神经毒素。其中仅突触后神经毒素就有100多种。蛇毒神经毒素根据作用机制可分为四类：突触前神经毒素(presynaptically-acting neurotoxin或βα一neurotoxin)、突触后神经毒素(postsy-naptically-acting neurotoxin或a-neurotoxin)、抗胆碱酯酶类神经毒素(anticholinesterase neurotoxin)和离子通道型神经毒素(ion-channel neurotoxin)。目前发现的镇痛成分几乎都是突触后神经毒素。

科学研究表明，突触后神经毒素是一条由60～80个氨基酸残基组成的多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性，分子量约为6000～8000道尔顿。突触后神经毒索有长链和短链之分，短链含60～62个氨基酸，四个二硫键.长链含66～74个氨基酸，五个二硫键。分子中的二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个肽链环就象三个手指，故其又被形象地称为三指蛋白(three-ringer protein)。突触后神经毒素几乎全部是碱性蛋白，等电点在9～10之间。由于分子量很小但二硫键很多，这类毒素的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性。

1936年Macht提出肌肉注射微量眼镜蛇毒具有类似吗啡的中枢镇痛作用。美国Hynson，Westcott&Dunning公司对眼镜蛇粗毒进行初步分离，制成Cobroxin和Nyloxin两种神经毒素制剂，用于治疗顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛，这两种药物已列入美国药物局方中。我国自1952年起开展对蛇毒神经毒素的镇痛作用研究，开发了一些制剂用于临床治疗疼痛，其中中国科学院昆明动物研究所研制的“克痛灵”注射剂(现名为科博肽注射液)，用于治疗坐骨神经痛、三叉神经痛、神经血管性头痛以及风湿痛等顽固性疼痛，疗效显著且副作用少。NT的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为作用效价高，维持时间久，无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。同时，NT还能戒除吗啡毒瘾，在戒毒方面有独特的治疗作用。

目前，获取眼镜蛇蛇毒中的神经毒素主要是通过捕蛇或养蛇取毒，对粗毒进一步纯化提取而得到，主要利用离子交换层析和凝胶层析。现有技术中，中国专利申请CN101845089A(公开日期2010年9月29日)公开了“一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法”，该方法将蛇毒层析洗脱后再过分子量为3K的超滤膜最后采用过氧化氢修饰神经毒素，步骤较繁琐，容易引入杂质，在实际生产中，蛇毒神经毒素在层析洗脱后仍存在一部分分子量大于神经毒素的至敏物质，且采用过氧化氢修饰神经毒素后对眼镜蛇神经毒素的长期稳定性并未作考察，规模化生产出的成品距离产品实际运用中仍然需要一定的考察时间。李范珠等在文献“浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究”(中国药师，2004年09期，P659～661)中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法为将蛇毒直接进行三次柱层析，耗时长，提取成本高，神经毒素的收率较低。龚潮梁等在“一种分离提纯眼镜蛇_Najanajaatra_神经毒素的简便方法”(动物学研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)一文中公开了采用CM-纤维柱层析分离神经毒素，70℃保温热变性处理杂质，低温冷丙酮提纯，然后用Sephadex G-10脱盐的方法获得纯化的眼镜蛇毒神经毒素，但是高温保温容易引起神经毒素大量变性沉淀，导致产物的生物活性降低，另外，由于盐在目标产物中的量较少且不会影响其活性，脱盐会导致有效成分损失，且操作繁琐，实际生产中耗费人力物力，使生产周期变长。