[发明专利]小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的分离纯化领域，主要是一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法。

背景技术

早在1973年美国学者Steinman就发现了具有强大抗原递呈功能的树突状细胞(Dendritic cells，DC)。这类细胞是目前所知机体内功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

它们通常少量分布于外界接触的皮肤部位，主要为皮肤和鼻腔、肺、胃与肠的内层。而肠道作为人体最大的免疫器官。一方面肠道对各类致病微生物产生免疫应答，消除病原体；另一方面对肠道正常定植的共生菌和日常大量食物蛋白产生免疫耐受，在这一过程中，作为体内功能最强的抗原递呈细胞，树突状细胞起到了关键的作用。肠道内各类抗原主要经过DC传递后，作用于T、B淋巴细胞，其产生的效应取决于DC的类型、接受到的信号分子以及局部微环境的影响。

介于树突状细胞在肠道免疫的重要地位，如何分离提取高纯度的DC成为首要任务。根据DC所在肠道位置的不同，主要可以分为在Peyer’s淋巴结(Peyer’s patch)DC，肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)DC以及在肠道上皮黏膜固有层(lamia propria，LP)DC。目前在提取Pp DC和MLN DC方面已经比较成熟，且文献报道较多。但在提取LPDC时，由于肠壁构成复杂，结构特殊，肠绒毛的固有层又含有致密结缔组织。所以导致了LPDC提取的诸多困难。如何有效得提取肠道上皮黏膜固有层树突状细胞成了亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的正是要克服上述技术的不足，而提供一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：本发明公开了小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，具体步骤：

①获取混合细胞：取出生4-6周的C57BL/6小鼠过度麻醉后，用外科手术剪剪开小鼠，取出小肠(十二指肠、空肠、回肠)；将小肠置于37°预热的HBSS Buffer(分离上皮细胞的缓冲液)中，去除脂肪、结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；肠尽可能剪碎，转移至50毫升离心管中加入30毫升37℃预热的HBSS Buffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的HBSS Buffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37℃预热的collagenase/DNase Solution(胶原酶/DNA酶混合液)，37℃水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤，滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟。

上述液体的配置如下：

a、HBSS

称取HBSS粉末4.9g，加入500ml的去离子水，然后用0.22μm滤膜过滤

b、HBSS Buffer(分离上皮细胞的缓冲液)

c、RPMI清洗缓冲液

d、collagenase/DNase Solution(胶原酶/DNA酶混合液)

RPMI Buffer        9.75ml

collagenase(1.75mg/ml)     5.25ml

DNase I                    0.0075g

②单个核细胞的获取：胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1∶1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACS buffer(美天旎分选缓冲液)，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞。所述MACS buffer是含有2mM(摩尔/毫升)的EDTA和0.5％的FCS(胎牛血清)的PBS(盐离子缓冲液)。