[发明专利]小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法

权利要求书

1.一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，其特征在于：具体步骤：

①获取混合细胞：取出生4-6周的C57BL/6小鼠过度麻醉后，剪开小鼠，取出小肠；将小肠置于37°预热的分离上皮细胞的缓冲液HBSS Buffer中，去除脂肪、结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；小肠剪碎后转移至50毫升离心管中加入30毫升37℃预热的HBSSBuffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的HBSS Buffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37℃预热的collagenase/DNase Solution胶原酶/DNA酶混合液，37℃水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤，滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟；

②单个核细胞的获取：胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1∶1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACS buffer美天旎分选缓冲液，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞；所述MACS buffer是含有2mM摩尔/毫升的EDTA和0.5％的FCS胎牛血清的PBS盐离子缓冲液；

③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取：Ficoll密度梯度离心得到的细胞用MACSbuffer重选，按照美天旎磁珠分选CD11c的说明分选树突状细胞。

2.根据权利要求1所述的小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，其特征在于：上述液体的配置如下：

a、HBSS

称取HBSS粉末4.9g，加入500ml的去离子水，然后用0.22μm滤膜过滤；

b、HBSS Buffer分离上皮细胞的缓冲液

c、RPMI清洗缓冲液

d、collagenase/DNase Solution胶原酶/DNA酶混合液

RPMI Buffer               9.75ml

Collagenase  1.75mg/ml    5.25ml

DNase I                   0.0075g。