[发明专利]一种苯酚降解菌及其转化吲哚制备靛蓝的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用一种野生型苯酚降解菌转化吲哚制备靛蓝的方法。

背景技术

靛蓝是一种广泛用于食品、医药、印染和化妆品等行业的古老色素，其化学合成的合成原料、催化剂、中间产物等均具有一定的毒性，给人和环境造成危害。

1983年Ensley等人开始采用生物法合成靛蓝，1986年Mermod N等将降解甲苯、二甲苯或甲苯其他衍生物的Pseudomonas putida mt-2的TOL质粒pWW0克隆到Escherichia coli K-12，获得的基因工程菌能催化吲哚直接生成3-羟基吲哚从而生成靛蓝。

利用野生菌合成靛蓝的报道较少，1997年Doukyu等利用假单胞菌ST-200的加氧酶在两相系统中进行生物合成靛蓝，当加入体积分数为20％的二苯甲烷时，假单胞菌对吲哚的最大耐受量为4mg/mL，靛蓝的生成量仅为5μg/mL；1997年Allen CCR等发现Rhodococcus sp.NCIMB 12038也能利用某种酶(可能是单加氧酶)催化吲哚合成靛蓝，文中主要探讨了菌株NCIMB12038合成靛蓝的独特现象和其可能的靛蓝合成机制，没有提到靛蓝的产量产率等问题。

现有的关于制备靛蓝的研究，涉及的酶资源较为单一，主要集中在萘双加氧酶、甲苯双加氧酶、苯乙烯单加氧酶和P450酶等，而且实际应用研究有限；大多数的研究都是利用基因工程技术调取相关合成基因进行重组，构建工程菌，关于利用野生型菌株合成靛蓝的研究较少，忽视了自然界原生菌株合成靛蓝的优势。

发明内容

本发明的目的，是提供一种降解苯酚的野生菌，以及采用该苯酚降解菌转化吲哚得到靛蓝类色素物质的方法，实现生物法制备靛蓝，产物浓度较高。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一种能有效催化吲哚合成靛蓝的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假单胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏编号为CGMCC No.5054。

用苯酚降解菌Pseudomonas monteilii QM催化吲哚合成靛蓝的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)利用苯酚诱导Pseudomonas monteilii QM菌在培养基中生长10～14小时至对数末期，然后离心分离，经pH值为7.0～7.5、浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液洗涤制备菌悬浮；

(2)在菌悬液中加入吲哚(吲哚用丙酮溶解)进行生物转化以制备靛蓝，生物转化反应时，反应液中Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为0.1～10g/L，吲哚浓度为25～200mg/L，在20～40℃温度下，控制摇床转速在50～300r/min，振荡反应1～8小时。

上述生物转化反应的最佳参数为：Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为4.0～8.0g/L，吲哚浓度为25～75mg/L，温度为25～35℃，摇床转速为150～200r/min，振荡反应时间为3～5小时。

Pseudomonas monteilii QM菌是用浓度梯度法从大连理工大学校园土壤样品中分离筛选获得的。采集土壤样品后，在富集培养基中富集培养，然后再转到以苯酚为唯一碳源的培养基中驯化。通过逐步减少培养基的营养成分直至混合菌液可以以苯酚为唯一的碳源生长，反复进行平板涂布，最终分离得到能以苯酚为唯一碳源生长的蒙氏假单胞菌；在该菌株的菌液中加入吲哚，它能将吲哚转化生成靛蓝。

该野生菌适宜在中性及偏碱性(pH 7.0～8.0)的培养介质中生长，适合生长温度为30～35℃，能在多种培养基上生长(如M9培养基、富集培养基、无机盐培养基)，在固体培养基上呈无色透明的圆形小点，表面光滑，边缘整齐，易挑起。细菌学形态特征：革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，大小约为(0.3-0.5)μm×(1-3)μm。通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1451bp的16S rDNA全序列。应用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，结果表明该菌株的16S rDNA序列与GenBank中Pseudomonas monteilii的很多菌株序列相似性高达99％，确定该菌株属于蒙氏假单胞菌，命名为Pseudomonas monteilii QM，其保藏号为CGMCC NO.5054。