[发明专利]乙酰胆碱酯酶的固定化方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的固定化方法和应用，具体地说，是将重组乙酰胆碱酯酶固定到Ni-NTA树脂上制成固定化乙酰胆碱酯酶的方法及其应用。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种重要的水解酶。它能够选择性地催化底物乙酰胆碱水解，其催化活性能被有机磷或氨基甲酸酯类农药所抑制。利用这一特性乙酰胆碱酯酶可用于检测有机磷及氨基甲酸酯类农药。因而，AChE在环保、医学、农业、军事等领域具有重要用途。但是游离酶性质不稳定，极易失活，不能重复使用。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性强，重现性好，能重复使用等优点。因此，酶的固定化技术研究已成为酶工程的重要组成部分。

目前，乙酰胆碱酯酶的固定化方法有吸附法、包埋法和交联法。吸附法根据物理吸附原理将乙酰胆碱酯酶吸附于载体上，此法的优点是方法简单易行，酶活保存完好。但是由于物理吸附作用力弱，因此采用吸附法固定的乙酰胆碱酯酶易流失，酶活下降快。包埋法将乙酰胆碱酯酶包裹在聚合物网格中，虽然解决了酶流失问题，但是，苛刻的聚合条件会使乙酰胆碱酯酶失活，并且包埋在聚合物深处的乙酰胆碱酯酶难于发挥作用。交联法采用双功能试剂将酶以共价键的形式牢固地连接到载体上，但是剧烈的化学反应仍然会使乙酰胆碱酯酶失活。因此寻找到合适的载体材料，研发出酶活性高、稳定性好、易于保存的固定化重组乙酰胆碱酯酶是相关产业部门十分期望的。

Ni-NTA树脂(His标签纯化树脂)是用于纯化His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由4％交联的凝胶耦连了一种四齿螯合剂NTA而得，带有Ni²⁺。目前，Ni-NTA树脂已被用来纯化含有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶，即将重组蛋白和经处理的Ni-NTA树脂混合后，利用亲和层析进行结合、洗涤、洗脱以纯化重组蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用Ni-NTA树脂制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法。

发明人在长期研究过程中，意外发现不进行洗涤、洗脱步骤能使含有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶有效地固载到Ni-NTA树脂上，直接用于酶活测定、抑制剂筛选和农药残留检测，并具有乙酰胆碱酯酶活性高、稳定性好、易于保存等优点。

本发明的目的是通过如下技术措施实现：

一种制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于：

A.原料准备

采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液；

用缓冲液洗涤Ni-NTA树脂，离心处理；

B.将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂混合，离心处理。

上述的基因工程技术是指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。步骤包括：

(1)DNA片段的取得，即目的基因的分离和制备

(2)DNA片段和载体的连接，制得重组体DNA

(3)外源重组DNA片段导入宿主细胞

(4)选择

(5)目的基因表达

发明人在实际操作过程中发现，在使用基因工程技术制备重组乙酰胆碱酯酶过程中，限制性内切酶、转移质粒载体、感受态细胞、宿主的选择也很重要，这些因素的合理选择与配合可进一步影响固定化乙酰胆碱酯酶的制备。

优选地，上述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71。

更优选地，上述重组DNA制备中感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株。

最优选地，上述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是pPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是Sal I。

发明人同时发现在利用此法制备固定化重组乙酰胆碱酯酶过程中，Ni-NTA树脂与酶液的用量，离心速度和时间，对固定化乙酰胆碱酯酶的制备效果有进一步的影响。

优选地，上述重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500μg·ml^-1及以上，粗酶液与处理后的Ni-NTA树脂按3∶1的体积比混合。

更优选地，上述缓冲液的配方是300mM NaCl，50mM Na3PO4，10mM咪唑，pH 7.4。

进一步优选地，上述缓冲液用量是Ni-NTA树脂体积的5倍。最优选地，上述离心操作的转速为3000rpm，时间为30秒钟。

具体地说，基因工程技术的操作步骤如下：