[发明专利]乙酰胆碱酯酶的固定化方法和应用有效
| 申请号： | 201110312502.4 | 申请日： | 2011-10-14 |
| 公开（公告）号： | CN102409037A | 公开（公告）日： | 2012-04-11 |
| 发明（设计）人： | 夏玉先;周小霞 | 申请（专利权）人： | 重庆大学;中国人民解放军第三军医大学 |
| 主分类号： | C12N11/08 | 分类号： | C12N11/08 |
| 代理公司： | 重庆弘旭专利代理有限责任公司 50209 | 代理人： | 周韶红 |
| 地址： | 400044 *** | 国省代码： | 重庆;85 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 乙酰 胆碱酯酶 固定 方法 应用 | ||
1. 一种制备重组乙酰胆碱酯酶固定化载体的方法，特征在于，采用如下步骤制备：
A．原料准备
采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液；
用缓冲液洗涤Ni-NTA树脂，离心处理；
B．将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂混合，离心处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的基因工程技术包括目的基因的分离和制备、重组体DNA的制备、外源重组DNA片段导入宿主细胞等步骤；
所述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71。
3.如权利要2所述的方法，其特征在于：所述重组体DNA的制备中，采用的感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是pPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是SalⅠ。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 mg·ml-1以上，粗酶液与处理后的Ni-NTA树脂按3：1的体积比混合。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤A中缓冲液的配方是300 mM NaCl，50 mM Na3PO4，10 mM 咪唑，pH 7.4。
7.如权利要求1、2或5所述的方法，其特征在于：所述缓冲液用量是Ni-NTA树脂体积的5倍。
8.如权利要求1、2、5或6所述的方法，其特征在于：所述离心的转速为3000rpm，时间为30秒。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
A．原料准备
采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液，所述的基因工程技术包括目的基因的分离和制备、重组体DNA的制备、外源重组DNA片段导入宿主细胞等步骤；所述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71；所述重组体DNA的制备中，采用的感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株；所述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是pPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是SalⅠ，用5倍体积的缓冲液（300 mM NaCl，50 mM Na3PO4，10 mM咪唑，pH 7.4）洗涤树脂三遍，以3000rpm转速离心30秒，弃上清；
B．将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂按3：1的体积比混合，离心处理，重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 mg·ml-1。
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