[发明专利]全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全蚕粉，尤其是涉及一种采用反相高效液相色谱测定全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的方法。

背景技术

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素是其降血糖的主要活性成分。1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有高效广泛的药理作用，对糖尿病及其并发症、肥胖症、病毒感染(HIV)等方面有着较显著的治疗效果。如何有效检测1-脱氧野尻霉素产品的质量，创建一种简便、快速、高效的检测1-脱氧野尻霉素含量的方法逐渐成为研究热点之一。测定1-脱氧野尻霉素含量的方法主要有以下四种：

第一种是离子色谱测定法，陈智毅等利用该方法分别对黄血蚕、蚕沙中1-脱氧野尻霉素进行了定量分析。

第二种是反相高效液相色谱-荧光检测法，欧阳臻等、Jin等分别对这种方法进行了研究，并测定了桑叶和全蚕粉中1-脱氧野尻霉素的含量。结果显示，离子色谱测定法具有样品处理简单、易操作等优点，但分离效果和可靠性不够理想；反相高效液相色谱-荧光检测法，具有灵敏度高，结果准确、可靠等优点，但要求的检测器价格昂贵，一般实验室中很少配置，在应用普及方面受到较大限制。

第三种是反相高效液相色谱-紫外检测法，此法虽然所用检测器普及于大多实验室，但是其样品需要柱前衍生化，衍生过程复杂，条件较难把握。

第四种，用蒸发光散射检测器来测定家蚕体内1-脱氧野尻霉素，此种检测器没有紫外检测器和荧光检测器灵敏。因此，探索一种在普通实验室就能进行测定复杂混合物中1-脱氧野尻霉素的含量，并且样品处理较简单的方法是颇有现实意义的工作，既可提供在普通实验室进行1-脱氧野尻霉素的分析，也便于企业进行家蚕药用产品生产过程中的1-脱氧野尻霉素质量检测。为此，探索稳定、准确的检测蚕样品中的1-脱氧野尻霉素含量的方法，研究RP-HPLC-UV方法的具体技术参数，获得稳定准确测定结果，具有重要的现实意义。

采用紫外末端吸收法检测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量，目前在国内外尚未见报道。

中国专利CNl883513公开一种全蚕粉中降血糖活性物质的分离方法。其分离步骤为首先将全蚕粉与浸提缓冲液按1∶1的比例混匀，置4～8℃环境下浸提、过滤、分离，进行全蚕粉降血糖有效成分的提取；然后将全蚕粉浸提液上离子交换柱层析，进行阳离子交换柱层析，并调整pH值；再洗脱、样品收集、浓缩与干燥。该发明保持了家蚕体内的原有活性物质，降血糖活性成分单一；产出量高，获得率为2.7％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不仅具有精密度较高、重现性和稳定性较好、加样回收率符合要求、方法简便实用等优点，而且可以普及于一般实验室等，并可用于全蚕粉制品中1-脱氧野尻霉素的质量控制的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法。

本发明包括以下步骤：

1)称定1-脱氧野尻霉素对照品各两份，作为对照品液1和对照品液2；

2)吸取对照品液1和对照品液2，进样；

3)称取待测全蚕粉，加入石油醚，在水浴中加热回流提取，过滤，弃去滤液，挥干石油醚，得产物A；

4)在产物A中加入甲醇，超声提取，过滤，将滤液浓缩，再置于中性氧化铝柱，洗脱，收集洗脱溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；

5)对步骤4)所得的供试品溶液进行HPLC分析，根据峰面积值，用外标两点法计算步骤3)所用待测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量。

在步骤1)中，所述对照品液1的浓度可为0.82mg/mL，对照品液2的浓度可为0.74mg/mL。

在步骤2)中，所述吸取对照品液1和对照品液2的可为各10μl。

在步骤3)中，所述待测全蚕粉每份可为0.5～2g，加入石油醚的量可为15～60mL；所述在水浴中加热回流提取的时间可为0.5～2h。

在步骤4)中，在产物A中加入甲醇的量可为15～60mL；所述超声提取的时间可为0.5～2h；所述将滤液浓缩，可浓缩至1～10mL；所述洗脱可采用0.02mol/L HCl洗脱并调节流速至20～60滴/min。

在步骤5)中，所述HPLC分析可采用包含有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，检测波长可为190～400nm，所用高效液相色谱的固定相为反相色谱柱，柱温可为20～50℃；所述流动相可为水与乙腈的混合液，其中有机相的比例可为20％～90％，以流动相质量为100％计，水在流动相中所占的质量百分比可为10％～80％，优选20％～70％，最好为30％～60％。

本发明的关键点在于，在上述流动相和波长条件下可以很准确地测定将全蚕粉及其制剂中1-脱氧野尻霉素的含量。