[发明专利]一种检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的基孔肯雅病毒检测试剂盒。 

背景技术

基孔肯雅病毒是一种重要的虫媒传播性传染病病原，随着人口流动性增强、生态环境改变等原因，其流行频率及流行范围在全球有日益扩大的趋势。2006年以来，基孔肯雅热席卷南亚的科摩多、毛里求斯、塞舌尔、马达加斯、马约特、法属留尼旺岛及印度，并迅速向欧洲、加拿大、加勒比海、南部美洲和美国扩散，导致数百万人染病，对公共卫生安全造成严重威胁。2010年9月底，我国东莞市暴发基孔肯雅热，并迅速导致数百人发病，这是我国首次出现的基孔肯雅流行，由于临近亚运会，作为一种新发传染病引起了媒体的广泛关注及民众的恐慌。我南方各省区地处热带、亚热带，气候炎热潮湿，媒介蚊虫种类繁多，广泛存在基孔肯雅病毒的宿主与传播媒介，随着全球范围内人员及经济往来的日益频繁，存在再次输入、暴发的可能。基孔肯雅病毒主要通过蚊虫叮咬在人群中传播，传播速度快，危害大，容易造成民众恐慌。因此，提前开展其快速检测技术的研究及产品储备，对公共卫生安全保障具有十分重要的意义。 

目前用于病毒免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法速度快，对实验要求不高，并能自动化、高通量的检测大量样品，同时也具有灵敏度高、可靠性强的优势，并且已经在不同的病原体检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，具有较高的应用价值。免疫胶体金快速诊断技术则是基于酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、免疫胶体金技术的新型技术，于1989年首次用于检测抗人类免疫缺陷病毒的抗体，其操作更为简便快速，只 需几分钟，阳性反应肉眼可见，不需特殊仪器，不受环境温度影响，试剂稳定易长期保存、特异性和敏感性均较高等优点，特别适用于野外以及实验条件不具备的场所使用，并已在多种病毒的检测中得到应用。在基层单位，以上两种方法有其他方法无法代替的优势，而其关键均在于特异性强、亲和力高抗原的制备，以提高特异性及检出率。 

现有技术中，关于基孔肯雅病毒免疫学诊断方法的研究方面，国内也已经见过多篇报道，但由于不同虫媒病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种虫媒病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。同时，由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染也十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。 

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与基孔肯雅病毒抗体具有极高亲和力。 

本发明的所解决的技术问题在于提供一种基孔肯雅病毒的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立基孔肯雅病毒抗体的ELISA快速检测技术。 

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。 

优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该重组抗原蛋白是通过选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表答而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。 

另一方面，本发明具体实施方式中还提供了一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤： 

一、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠； 

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段； 

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；