[发明专利]一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于贝类育种技术领域，具体涉及一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法。

背景技术

华贵栉孔扇贝[Chlamys(Minachlamys) nobilis(Reeve，1852)]为暖水性贝类，自然分布于日本的本州、四国、九州，中国的南海及印度尼西亚等地。在广东省沿海的海门、遮浪、大亚湾、大鹏湾、闸坡等地均有分布。华贵栉孔扇贝为雌雄异体型海洋双壳贝类，1年左右达性成熟，雌性性腺为橘黄色，雄性性腺为乳白色，繁殖期在广东沿海为5-10月，以5-6月为繁殖盛期，可产卵300-1500万粒。广泛存在雌雄同体及性转换现象。周年内进行性转换的比例占总数的4.47%，其中雄性进行转换的比例是5.17%，雌性进行转换的比例是4.0%。雌、雄同体及性转换主要的发生时间在12-2月和7-8月。

目前，理论上有两种方法进行生物体纯合体的构建培育，其中基因纯化速度最快的是通过雌核发育或雄核发育，但目前对贝类的雄核发育研究尚无报道，对贝类的雌核发育虽有一些研究，但在技术方面难度很大，目前尚不能在实际研究中进行应用。另外一种方法是近亲繁殖，包括自交、全同胞交配、半同胞交配、回交等多种交配策略。其中，近亲繁殖中亲缘关系最近的交配方式是自交，自交的基因纯化速率远远快于其它的近交方式，自交主要是利用雌雄同体或性转变现象建立自交系，在技术上可有两种方法：一是利用精子低温冷藏技术和性转现象结合进行自交建立自交系，但目前海水贝类的精子低温冷藏技术研究还处于初期阶段，该技术的应用还需以时日；另一种较可行的方法是利用雌雄同体个体的成熟精卵通过自体受精建立自交系。太平洋牡蛎是一种雌雄异体型贝类，Hedgecock等（1995）利用少数的雌雄同体个体的雌雄配子进行自体受精建立了自交系，王梅芳等（2006）对马氏珠母贝雌雄同体个体的自体受精及其早期胚胎发育进行了研究，发现自体受精的受精率明显低于异体受精，发育过程中有较多的卵裂球解体，部分胚胎可发育成D型幼虫，但未能培育出幼苗。张国范等（2003）成功地利用雌雄同体型的海湾扇贝构建了自交家系。对于雌雄异体型贝类，其雌雄配子同体个体的比例较低，而且其雌、雄配子同时发育成熟的情况更是少见。在华贵栉孔扇贝，虽然通过组织切片观察到了雌雄同体现象的存在，但利用该现象构建自交系的方法并没有报道，而且也未见通过解剖法进行人工授精方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法。

本发明采取如下方案达到上述目的：从华贵栉孔扇贝中选择出雌雄同体的个体，采用自交的方法建立和培育自交系。

所述的自交的方法为：挑选性腺成熟的、外观上为雌性的华贵栉孔扇贝，显微镜检查性腺组织，挑选出同时含有卵和精子的个体，即雌雄同体型个体，对其进行诱导催产，每个个体在相互隔离的条件下独立排放精、卵，并使同一个个体所产的精、卵进行自体受精，然后按该物种的常规技术进行胚胎孵化、幼虫培育及养成，在操作过程中采取常规的隔离措施，避免自交系以外的个体混入其中。

其操作步骤如下：

雌雄同体个体的鉴别：将性腺饱满的、颜色为橘黄色的贝编号，每一个贝用注射器针穿刺性腺组织，涂抹在载玻片上并滴一滴海水，将载玻片上置于显微镜下观察，如样品中含有卵和精子，则该个体为雌雄同体型。

催产和授精：将挑选出的雌雄同体个体阴干 30-60 分钟后，流水冲20-30分钟，将每个贝单独放入一个容器中，每个容器中事先加入比原培育水温高 3- 5 ℃的海水。观察贝的精卵排放情况。将同一个个体所产的卵子与精子进行受精，避免其他个体的配子混入。

针对精卵排放不同步及数量差异悬殊的具体情况，本发明在催产和受精过程中采取下述措施人为增加或减少精子数量以对水体中精、卵的相对比例进行人工干预和调节：对于先产精后产卵的情况，当含有精子的水体呈现乳白色时，将贝取出置于另一容器中继续排放，并保留精液；当该贝开始排卵时，即刻将该贝取出并冲洗，然后置于新鲜的过滤海水中让其产卵，当产卵水体中卵的数量达到10个/mL以上或不再排放时，取样于显微镜下观察，当 50 ％以下的卵子外周可观察的精子数量少于一个时，按体积比1：100加入该贝的精液，并搅动水体，3- 5 分钟后取样于显微镜下观察， 到90%以上的卵子外周可观察到1-2个精子时停止加入精液；30分钟后用虹吸法换水。对于先产卵后产精的情况，当产卵量达到10个/mL以上时，将贝取出置于另一容器中让其排精，然后按体积比1：100加入精液该贝所产卵中。