[发明专利]一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其是涉及一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法。

背景技术

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是一种危害严重的动物病毒，它引起的猪瘟每年给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界上主要采用弱毒活疫苗免疫来防治猪瘟，以控制猪瘟的流行。在异源原代细胞中增殖的猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是目前我国主要的弱毒疫苗。C株是我国五十年代经兔体传代选育出的一株具有良好免疫保护力的疫苗株。由于该疫苗株性能稳定、安全、保护性好，是国际上公认最好也是应用最为广泛的疫苗株。由于应用的需要，我国猪瘟病毒的疫苗生产也由兔脾淋疫苗、全乳兔疫苗逐步过渡到用组织培养生产的细胞疫苗。为避免猪体可能带有的病原体(包括病毒)对疫苗质量的影响，目前生产上使用牛睾丸或羊肾细胞增殖猪瘟兔化弱毒疫苗。

由于我国牛群中病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染率很高，几乎是100％，因此用牛睾丸细胞生产猪瘟疫苗，易造成细胞外源病毒污染，且病毒滴度不高，生产工艺不稳定，疫苗批次之间的差异大，严重影响了疫苗的质量；同样，使用羊肾细胞生产猪瘟疫苗，由于羊群中可能存在边界病毒(BDV)，也存在同样的隐患。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、羊边界病毒(BDV)与猪瘟病毒(HCV)同属于黄病毒科瘟病毒属，三种病毒之间有较密切的抗原性与血清学关系，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体，使用污染了BVDV或BDV的猪瘟细胞疫苗给猪只免疫接种后，BVDV或BDV会对猪瘟疫苗的免疫产生干扰作用，能抑制猪瘟抗体的产生，引起严重的后果。

国内一些研究单位和动物疫苗生产厂家尝试使用细胞系生产猪瘟疫苗，从一定程序上可以避免外源病毒污染，提高免疫效果，但是传代细胞存在致瘤的可能性，用于猪瘟疫苗的生产有潜在的食品安全上的危险。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足之处，提供一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法。该方法生产工艺简单、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗质量。利用本发明生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击能产生完全的免疫保护作用。

本发明的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其步骤包括：制苗用细胞的选择、制苗用细胞的制备、细胞毒种的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分装及冻干，其具体步骤如下：

1、制苗用细胞的选择：为健康乳兔或成年兔的肾脏或睾丸；

2、制苗用细胞的制备：

(1)兔肾(或兔睾丸)的采集和处理：先以常水泡湿兔毛，取出后沥干，再放入1％新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔肾(或兔睾丸)，迅速放入含400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、肾盂、肾盏、附睾，组织称重后，将其剪成1～2mm小块，用汉克氏液反复冲洗，至上清液清亮为止；

(2)消化：将组织块移入消化瓶中，兔肾加入5～6倍(兔睾丸加入6～8倍)组织质量体积比的0.25％胰酶溶液，塞紧瓶口，置37℃水浴消化60分钟。消化过程中，每隔10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；

(3)细胞分散：加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止，待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3～4次。

(4)细胞分装和培养：将收集瓶中的细胞悬液充分摇匀后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒(兔肾细胞)或继续传代(兔睾丸细胞)。

(5)细胞传代：兔睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以(1∶3)～(1∶5)制成次代细胞悬液，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。

(6)细胞检验：细胞用于接毒前，按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录40～44、49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体、外源病毒生长。

3、细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液接种生长良好的上述细胞单层，继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；