[发明专利]一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法

权利要求书

1.用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：包括以下技术步骤：

(1)制苗用细胞的选择：为健康乳兔或成年兔的肾脏或睾丸；

(2)制苗用细胞的制备：

A)兔肾(或兔睾丸)的采集和处理：先以常水泡湿兔毛，取出后沥干，再放入1％新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔肾(或兔睾丸)，迅速放入含400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、肾盂、肾盏、附睾，组织称重后，将其剪成1～2mm小块，用汉克氏液反复冲洗，至上清液清亮为止；

B)消化：将组织块移入消化瓶中，兔肾加入5～6倍(兔睾丸加入6～8倍)组织质量体积比的0.25％胰酶溶液，塞紧瓶口，置37℃水浴消化60分钟。消化过程中，每隔10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；

C)细胞分散：加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止，待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3～4次。

D)细胞分装和培养：将收集瓶中的细胞悬液充分摇匀后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒(兔肾细胞)或继续传代(兔睾丸细胞)

E)细胞传代：兔睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以(1∶3)～(1∶5)制成次代细胞悬液，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。

(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液接种生长良好的上述细胞单层，继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；

(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层细胞的上述细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；

(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器中，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。

2.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)、(4)中所述的细胞培养温度是36～37.5℃。

3.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(2)中所用生长液的配方是：90％～92％乳汉液、8％～10％犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为7.0～7.2。

4.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(3)、(4)中所用维持液的配方是：90％～98％乳汉液、2％～4％犊牛血清或8～10％马血清、加适宜抗生素，pH值调整为7.2～7.4。

5.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的接种量为含0.3％～0.5％脾毒种的维持液。

6.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的接种量为含3％～5％生产用细胞毒种或0.2％～0.3％脾毒种的维持液。