[发明专利]一株多菌灵降解木霉菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物高技术领域，涉及一种多菌灵农药残留降解木霉，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。

背景技术

多菌灵（Carbendazim，MBC）是一种广谱高效低毒的内吸性杀菌剂，化学名称为N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯，对各种农作物、瓜果蔬菜病害具有较好的防治效果，也是其他杀菌剂，例如苯菌灵、甲基硫菌灵等咪唑类杀菌剂的代谢中间产物。据统计，我国2006年农药需求总量（有效含量）为29.96万吨，其中多菌灵的需求量在0.8～1.0万吨。多菌灵在土壤和水中性质非常稳定，降解半衰期较长，在蔬菜、果品和土壤中残留与累积可通过食物链影响人体健康，例如导致染色体畸变，引起肝病等。2002年被我国列为环境激素类化学农药。因此，多菌灵在环境中的降解研究愈来愈受到人们的关注。

生物降解是去除环境中多菌灵残留的主要途径，目前已报道的多菌灵降解菌均为细菌类。现有的木霉菌类对多菌灵几乎没有降解功能，甚至在多菌灵污染严重的土壤中无法生存和繁殖。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供一株具有多菌灵降解作用的生防木霉菌株及其

制备和应用。

    本发明提供的一株可降解多菌灵的生防菌株为木霉（Trichoderma sp.）Tr1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏号为CGMCC No.5210，保藏时间为2011年9 月 1 日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述的可降解多菌灵的木霉菌株（Trichoderma sp.）Tr1是利用含有多菌灵的无机盐培养基，从受多菌灵污染的土壤中分离、筛选、培养获得的。该菌株不仅对多菌灵具有良好的降解效果，对各种病原菌也具有一定的抑菌效果。该发明为获得降解多菌灵的木霉菌制品奠定了基础。

     本发明所述的可降解多菌灵的生防菌株木霉（Trichoderma sp.）Tr1的分离培养条件，包括下列步骤：

采集日照东港区三庄镇吉洼村某长期施用多菌灵的葡萄园耕作土层（10-30cm），称取土样10g，加到100ml多菌灵浓度为1000μg/ml的无机盐培养基中，28℃150r/min摇床培养7d，吸取10ml培养液转接到相同培养基中，培养7d，共连续转接5次。取1ml培养液，稀释10^-5，取200μl培养液均匀涂布于固体无机盐培养基（其中添加100μg/ml链霉素用于抑制细菌）中，28℃培养至平板上出现单菌落，将菌株转接到PDA平板（其中添加100μg/ml链霉素用于抑制细菌）上，28℃恒温培养，反复纯化至纯培养后，转接到无机盐培养基中继续摇床培养，利用HPLC检测菌株对多菌灵的降解能力，筛选对多菌灵降解能力最强的菌株进行保藏，即为保藏号为CGMCC No.5210的木霉（Trichoderma sp.）Tr1菌株。

    将上述培养筛选获得的菌株转接到PDA平板上，发现该菌株在PDA平板上菌落初期气生菌丝呈白色致密丛束状，边缘松散，呈发散状生长，背面初期无色，后期出现菌丝产孢区，颜色从浅绿渐至深绿色。分生孢子梗从菌丝侧枝生出，呈十字轮生排列，顶生分生孢子，分生孢子光滑，亚球形至卵形（图1）。通过一系列培养形状及光学显微镜观察，经鉴定为木霉属（Trichoderma sp.）。

    上述培养、筛选木霉（Trichoderma sp.）Tr1的培养基配方如下：

     无机盐培养基（g/L）：NaCl 1.0g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 1.0g，蒸馏水 1000mL，多菌灵（100mg/mL）10ml。

     固体无机盐培养基（g/L）：上述无机盐培养基中添加琼脂10g。

     PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g，蒸馏水 1000ml。

     本发明所述木霉（Trichoderma sp.）Tr1的发酵生产方法如下：