[发明专利]一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法

权利要求书

1.一种肌酸酐含量检测试剂，其特征在于：包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5(6)-羧基-2，7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了5(6)-羧基-2，7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根过氧化物酶：荧光染料的重量比为：1∶50∶60∶5。

2.根据权利要求1所述的肌酸酐含量检测试剂，其特征在于：包括如下三层结构：

(1)染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；

(2)蛋白酶固定层：在PVA-Sbq(聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物)的水溶液中加入10％的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；

(3)顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10％炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干。

3.根据权利要求2所述的肌酸酐含量检测试剂，其特征在于：三层结构的具体制备步骤如下：

(1)将176mg纤维素固定的5(6)-羧基-2，7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4％D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

(2)将步骤(1)中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

(3)将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10％并含有10％牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

(4)在步骤(2)中制备的薄膜上涂上步骤(3)中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

(5)在步骤(4)中所制备的薄膜上涂上一层含有6％炭黑和1.8％D6的溶液并自然风干。

4.一种肌酸酐含量检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2或3所述的检测试剂。

5.一种如权利要求4所述的肌酸酐含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)将176mg纤维素固定的5(6)-羧基-2，7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4％D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

(2)将步骤(1)中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

(3)将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10％并含有10％牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

(4)在步骤(2)中制备的薄膜上涂上步骤(3)中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

(5)在步骤(4)中所制备的薄膜上涂上一层含有6％炭黑和1.8％D6的溶液并自然风干。

6.一种如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：在含有100mM HEPES，150mM氯化钠，5mM氯化钾，1.3mM氯化钙的缓冲液中，pH 7.3，加入不同浓度肌酸酐，用毛细管两驱150μL的样品溶液并安插在试剂盒上并用荧光仪开始测量。