[发明专利]一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离培养领域，具体涉及一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法。 

背景技术

精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）是哺乳类动物雄性成体内唯一可将遗传信息传递给下一代的干细胞，它具有多潜能性，能被诱导分化成多种类型的细胞，在一定情况下它还能生成拟胚体，是一种天然不用转基因就能得到IPS细胞良好材料，而且它生成精子，完成基因的传递，伴随着转基因技术的兴起，它成为一种新的转基因途径。 

精子发生是一个复杂的过程，是维持雄性生殖能力和生命延续的前提。深入了解精子发生的分子和细胞机理，保护濒危动物物种以及治疗人类因化疗和放疗引起的内源性SSCs 损伤和恢复男性生育能力。精原干细胞技术与动物选种工作相结合，将会大规模的生产出优良家畜。 

SSCs具有多潜能性并分化为来源于三胚层的多种组织细胞，精原干细胞为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源成为可能。其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用提供了研究基础，对临床医学有较大应用价值。 

精原干细胞不仅对生物学、生物学技术、医学和发育学等方面的研究具有特殊的价值，使其成为近年来国内外的研究热点。 

目前研究主要SSCs的分离方法主要集中在机械法和两步酶法消化；而纯化方法主要有：差速贴壁法，percoll密度梯度离心法，自然重力沉降法，流式细胞术分选以及免疫磁珠等分选等方法，各种方法都存在着优缺点，根据需要来选择。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有的细胞分离培养中存在的不足，提供一种获得细胞容易，培养时间短，细胞增殖快、状态好且操作简便，实验成本低的分离培养猪精原干细胞的方法。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法，包括如下步骤：

（1）将仔猪的睾丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗涤2~3次，去除血污；

（2）去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪成小块，转移到培养皿中；

（3）加入10倍体积的PBS，用吸管吹打，静置，待睾丸组织沉到底部后，弃上清；

（4）重复步骤（3）2~3次；

（5）加入10倍体积的胶原酶消化，于37 ℃的水浴锅100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到组织块；

（6）加入5~10 ml的PBS，吹打，在16 ℃、600 rpm离心5 min，弃上清，收集底部细胞；

（7）用差异贴壁培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种到事先用0.1 %明胶包被的培养瓶中，在无菌培养箱中培养。

作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养箱的培养条件为37 ℃，5 % CO₂，饱和湿度。 

通过MTT法对比三种培养基，DMEM、DMEM-F12、α-MEM以及血清浓度5 %，10 %，15 %三种浓度培养效果，得出了DMEM、15 %血清浓度最为适合猪SSCs的增殖培养。根据文献报道，添加非必需氨基酸；β-巯基乙醇，L-谷氨酰胺等是培养细胞基础，起到了营养，抗氧化和能量物质的作用。如表一所示： 

表1 不同培养基和血清浓度对猪SSCs增殖率的影响

注：同列数据肩标字母相同或未标表示差异不显著（p＞0.05），字母不同表示差异显著（p＜0.05）。

  

根据表1，两因素方差分析结果显示，培养3 d后，不同培养基对猪SSCs增殖率无显著性影响，但是培养5 d后，DMEM和DMEM/F₁₂处理组的猪SSCs增殖率显著高于α-MEM组，而培养7 d后，DMEM处理组的猪SSCs增殖率显著高于α-MEM组和DMEM/F₁₂组；培养3 d后，不同血清浓度对猪SSCs增殖率也无显著性影响，但是培养5 d和7 d后，血清浓度为15 %处理组的猪SSCs增殖率显著高于5 %和10 %血清浓度组。多重比较结果显示，培养3 d后，当血清浓度为5 %、培养基为DMEM/F₁₂时，猪SSCs增殖率最低；而培养5 d和7 d后，血清浓度为15 %、培养基为DMEM时，猪SSCs增殖率最高。可见DMEM培养体系是更适合猪SSCs的培养体系。