[发明专利]一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用。

背景技术

β-葡聚糖是一类非淀粉性多糖(NSP)，是谷物类植物细胞壁的主要成分，在大麦、燕麦、小麦、水稻胚乳细胞壁中含量尤为丰富(Buliga et al.Carbohydr Res 1986，157：139-156)。谷物胚乳细胞壁β-葡聚糖是由1200个以上吡喃型D-葡萄糖残基以β-1，4和1，3-糖苷键连接形成线型分子。β-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子量的形式溶于水，且溶液粘度很高，给工业生产带来诸多不便。如：高分子量的大麦β-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，啤酒非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。β-葡聚糖在消化道中吸水膨胀黏连，使其成为限制麦类饲料营养成分有效利用的主要抗营养因子。

β-葡聚糖酶可以水解谷物中β-葡聚糖成为较小的聚合物，消除谷物类β-葡聚糖造成的负面影响，是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶。根据酶作用底物糖苷键的类型和机制，可将β-葡聚糖酶分为β-1，3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、β-1，4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3.2.1.4)、β-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)等(McCarthy et al.Int J Biol Macromol.2003，33：141-148；Boyce and Walsh.Appl Microbiol Biotechnol.2007，76：835-8412007)。

β-葡聚糖酶广泛的存在于植物和微生物中。微生物是葡聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。现在人们主要从细菌如枯草芽孢杆菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取β-葡聚糖酶。而天然菌株葡聚糖酶产量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。1983年爱尔兰学者Cantwell和McConnell首先从枯草芽孢杆菌中克隆到β-葡聚糖酶基因并建立了检测手段(Cantwell and McConnell.gene.1983 23(2)：211-219)。随后，人们从许多其他的微生物中克隆得到了β-葡聚糖酶基因，并进行序列分析和异源表达，葡聚糖酶的表达量得到很大提高。但目前，挖掘分离高比活、性质优良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，实现葡聚糖酶的高效表达，仍然是提高β-葡聚糖酶产量、降低生产成本的关键。本发明的β-葡聚糖酶作用pH范围广，在pH1.5-5.5范围内具有80％以上的酶活，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。其具有高比活性，其比活高于目前报道的β-葡聚糖酶的比活，并在毕赤酵母中实现了高效表达，表达量高于30,000U/ml，应用于工业生产葡聚糖酶可大大降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA。

本发明的另一目的是提供编码上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的应用。

本发明分离筛选出一种生产上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-1(Rhizopus oryzae)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5132。

本发明提供了一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MLKSVITSLL VANLLFTSSA QGWVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGF

VQYVDKSTAQ              60

SAGLISTQGG KVIMRADNTT VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHM

PVGCGTWPAF             120