[发明专利]一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

布鲁氏菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本实验室曾构建了wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。其后，又进一步构建了wboA基因不完全缺失株，系统地研究了wboA基因的不同缺失对重组菌的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了wboA基因1-897之间的片段为缺失的靶片段。

虽然有报告通过插入抗性基因获得重组粗糙型布鲁氏菌，但由于抗性基因导致的潜在生物安全隐患限制了其作为疫苗开发的可能。

发明内容

本发明的目的是通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，构建获得了具有生物安全意义的粗糙型布鲁氏菌，以该重组菌制备的布鲁氏菌活疫苗比现在使用的布鲁氏菌S2株生产的布鲁氏菌活疫苗具有更好的安全性，且该疫苗免疫动物后不干扰布病的临床检测。

本发明是采用蔗糖敏感基因的负筛选技术，缺失猪布鲁氏菌(Brucella suis)S2菌株(本发明又简称为布鲁氏菌S2株)wboA基因1～897bp之间的序列，构建重组布鲁氏菌rS2-ΔWboA株，使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，且具有良好的体内外存活能力；用一对特异性引物，通过PCR方法可以与非重组的原始菌相区分；用该菌株制备的布鲁氏菌活疫苗免疫动物后的血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

本发明是通过以下步骤实现的：

1.蔗糖敏感基因转移质粒构建

将含有启动子序列的蔗糖敏感基因(SucB^R)通过Nde I酶克隆近pUC18载体中，构建重组质粒pUC-SacB。将WboA基因(1～897位)的上、下游同源臂(L和R)的PCR产物分别克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC-L-R。通过一对引物，以pUC-L-R为模板，将包含L和R的片段扩增后通过Sal I和Sma I克隆进pUC-SacB质粒中，获得重组穿梭质粒pL-R-SacB。将重组穿梭质粒按常规方法电转化进布鲁氏菌疫苗S2株的感受态细胞中。

2.重组菌的筛选与鉴定

利用pUC18载体中的氨苄抗性(Amp^R)以及克隆进的蔗糖抗性(SucB^R)基因进行筛选。首先用50μg/ml Amp筛选出重组菌(第一次同源重组)，重组菌在不含氨苄的TSB培养后，再通过5％蔗糖TSA平板筛选出丢失氨苄抗性基因和蔗糖敏感基因全的重组菌(第二次同源重组)。通过一对PCR引物，鉴定wboA基因缺失的重组菌。对获得的重组布鲁氏菌进行形态学、血清学及基因水平检测，并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。

3疫苗制备