[发明专利]一种人脐带间充质干细胞分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，属于生物制品细胞分离培养技术领域。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有能自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要来源于成人骨髓以及脐带血。对于成人骨髓来源的间充质干细胞，由于其数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且病毒感染率较高，加之供者的骨髓采集需进行骨髓穿刺术，故其获取受到一定的限制；近年来，有大量研究表明人脐带中也存在大量间充质干细胞，且具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，正逐渐取代其他来源的间充质干细胞成为MSCs研究领域的热点之一。

脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含来自中胚层的胶样结缔组织。大量研究证实脐带中含有丰富的间充质干细胞，其来源主要分四种：来源于Wharton’s jelly；来源于脐血管周围；来源于脐血；来源于脐静脉血管内皮下。

由于人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有自身独特的优点和特性，有望成为细胞移植治疗各种疾病的良好细胞来源。其优点主要体现在以下几个方面：首先，hUCMSCs具有很强的粘附性，当进行低密度细胞培养时能迅速贴壁，且增殖速度快。在体外可被诱导为成骨细胞、成脂细胞、神经细胞等，具有多向分化潜能，；其次，hUCMSCs不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如CD80、CD40、CD46、CD40L，是一类免疫缺陷细胞，可被用于治疗急性移植物抗宿主反应(GCHD)；再者，分娩后的脐带属于废弃物，取材十分便利，且不受伦理道德方面的限制；最后，hUCMSCs的含量十分丰富，有研究表明一根30厘米长的脐带中可以分离培养得到10⁷原代细胞，且细胞分化能力强，生物学性能稳定，多次传代后仍能保持较强的增殖及分化能力，为科研工作及临床治疗提供了充足的细胞来源。综上所述，由于脐带间充质干细胞在各方面都展现出强有力的优势，故在细胞治疗领域具有十分广阔的应用前景。

近年来，随着科研工作者对hUCMSCs研究兴趣的日益浓厚，以及应用范围的愈发广泛，hUCMSCs的分离培养方式也日益便利和完善，主要是以酶消化法，或植块法获得一定数量的脐带间充质干细胞。有关脐带间充质干细胞的分离培养方法的研究以及专利的申请集中于酶消化获取细胞的方法，主要区别在于酶的种类，如胰酶消化，胰酶及胶原酶联合消化，胶原酶、透明质酸酶及中性蛋白酶联合消化。但酶消化法分离脐带间充质干细胞的方法存在一些缺陷，首先，酶消化需要消耗一定时间，使分离时间延长；其次，使用动物源的酶制剂消化脐带，给脐带间充质干细胞的后期临床应用带来了一定影响；再次，酶消化法过程较为繁琐，且稳定性差。细胞分离之后多选用以间充质细胞培养基，即含有一定比例胎牛血清的DMEM系列培养基进行培养，且传代时选用胰酶-EDTA作为消化溶液。在上述处理过程中，需不断接触动物来源的各种生物制剂，如，胎牛血清，胰蛋白酶-EDTA，这些生物制剂的使用不利于间充质干细胞的临床应用安全性的保证，限制了脐带间充质干细胞研究及应用的进一步发展。

发明内容

本发明针对现有的脐带间充质干细胞分离培养中涉及到有关使用过多动物来源的生物制剂给其临床应用发展带了不利因素的问题，提供了一种无血清、安全稳定、可以迅速得到大量安全无毒的脐带间充质干细胞、操作简单以及安全高效的人脐带间充质干细胞分离培养方法。

本发明为实现技术目的采用的技术方案为：

一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括以下步骤：

(1)取足月剖宫产胎儿脐带，无菌条件下用PBS冲洗，去除残留血迹；

(2)在动物细胞培养基中用无菌剪刀将步骤(1)中洗净的脐带剪成组织块，去除组织块的血管并将组织块弄碎；

(3)将步骤(2)中剪碎的组织块或绞碎的组织匀浆置于离心管中与动物细胞培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为1600～2200转/分钟，离心5～10分钟弃去上清，重复2～4遍；

(4)将离心沉淀部分与配置好的MesenCult-XF完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(5)培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加MesenCult-XF完全培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。