[发明专利]一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法

说明书

技术领域

本发明书属生物医学技术应用领域。具体涉及一种体外分离人类骨髓、脐带血及外周血中干细胞的方法，特别是一种人类骨髓、脐带血、外周血干细胞处理试剂盒及细胞处理方法。

背景技术

随着现在科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术不断地发展和优化，目前的干细胞分离处理方法包括免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法、培养扩增法及密度梯度离心法等，但是皆存在诸多的弊端。(1)免疫磁珠法通过包被在磁珠微粒上的抗体与细胞表面相应抗原阳性的细胞反应结合，然后通过磁性吸附原理将非吸附的细胞去除掉，收集被磁珠抗体吸附的细胞，此方法造价高，增加了患者的负担，不利于项目的推广和普及，而且对细胞活性有损伤，影响细胞疗效。(2)流式细胞仪法也是利用对目标细胞进行标记识别的原理通过流式细胞仪进行分选、收集。该方法存在筛选细胞范围小、细胞被标记后活性降低以及无法预知标记物在人体内的影响；而且该方法细胞污染风险高(3)血细胞分离机法只适用于从外周血中分离干细胞，应用受到限制；该方法需要给患者注射干细胞动员剂而增加治疗负担，同时分离后干细胞量小、液体体积大，对患者存在危险；(4)体外培养扩增法则需要对采集人类血液细胞进行培养，再清洗使用，此方法增加了污染风险，同时干细胞向未知方向分化为未知干细胞，培养时间长。

目前基于密度梯度法的干细胞分离方法在临床上得到较广的应用。但是不同方法及操作步骤产生的效果不同，各有利弊，总体而言，存在如下几个问题：

(1)不能标准化。比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”需要操作者自己配制工作液，而且需要调节比重，此方法增加了操作者的人为影响因素，不利于干细胞分离的推广和产业化。

(2)红细胞去除不干净：比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”特别是对于脐带血来说，该专利方法除不净红细胞，最终临床应用的时候大大增加了患者产生排异反应的风险；申请号为200910187212.4的“人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法”也存在相同的缺点；

(3)干细胞得率不高：比如申请号为200610114475.9的“用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒”，其缺点是分离的干细胞得率数量不高，需要进行细胞培养，但是由此增加了细胞污染率，同时体外细胞扩增所产生的细胞功能性不稳定，很难用于临床治疗；另外申请号为200610106875.5的“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”所采用的HISTOPAGUE077的密度1.077的淋巴细胞分离液，经分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样直接导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数，影响临床疗效；

(4)分离纯化成本太高：比如申请号为200710137781.9的“骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法”的专利，其试剂中添加了lin抗体，导致成本大大提高，投入临床使用后，大大增加了患者的经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后对人体的影响还是个未知数，还有待进一步研究。

(5)没有考虑蛋白沉淀、细胞凝聚因素对后期干细胞应用的风险：采用离心的方式分离纯化干细胞，在操作过程中往往由于脐血、外周血样品质量不同，干细胞在纯化过程中产生凝聚和沉淀，但此沉淀如果没有及时去除，在后期的应用过程中容易造成患者的微血管栓塞，影响治疗效果，严重者可危及患者的生命安全。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了提供一种操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，它从根本上解决了现有细胞分离技术中存在的造价高、细胞活性低、标记物进入人体后对人体影响不明，需要注射动员剂造成患者痛苦，繁琐不适用临床等问题。同时本试剂盒易于存储运输、可产业化、使用方便快捷。

本发明的技术方案是：人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，其技术要点是所述试剂盒中包含以下四种试剂：

A号液为稀释液：PBS液；

B号液为密度液：泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077或Ficoll；泛影酸钠-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的密度液；

C号液为洗涤液：0.9％氯化钠注射液；

D号液为除红细胞液：0.8％氯化氨溶液；