[发明专利]四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺

权利要求书

1.四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选用菌种：生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种；

（2）种子批的建立及传代：将1支原始种子冻干菌种开启后，接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃、5～10%二氧化碳环境培养16～20小时传第二代，将第二代培养物采入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备主代种子批；再将1支主种子批菌种开启后，接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃、5～10%二氧化碳环境培养16～20小时传第二代，冻干为工作种子批；所述主种子批和所述工作种子批菌种冻干后进行生物学特性检定，所述主种子批和所述工作种子批菌种的生物学特性与原始种子批菌种一致； 

（3）生产疫苗原液：开启工作种子批菌种1支，接种于10%羊血琼脂培养基制备第一代，将第1代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第2代，将第2代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第3代，将第3代菌种接种于改良半综合液体培养基，继续传代第4代，继续将第4代菌种接种至大罐培养, 大罐培养为第5代，第5代的大罐培养为改良半综合液体培养基；第5代大罐培养的培养物生产疫苗原液，每1支工作种子用于1批疫苗原液生产；所述第5代大罐培养采用培养罐液体培养；

（4）收获及杀菌：于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为1%，杀菌30分钟；

（5）去菌体：将已杀菌的培养液经14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为1500～1600ml/min,收集上清液；

（6）沉淀、解离：所述步骤（5）收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为0.1%，充分混匀，A群静置3～5小时，Y 群静置5～8小时， C、W135群静置8～12小时；以14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为2000～2500ml/min，离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用1mol/LCaCl₂研磨均匀，得到混匀的多糖复合物；将所述混匀的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离；

（7）去核酸：在多糖复合物中加入2～8℃冷却过的95%的乙醇至终浓度按体积分数计为25%，摇匀，2～8℃存放，A群多糖静置存放1～3小时， C群和W135群静置存放16～20小时，Y群多糖静置存放10～14小时；4000rpm离心30分钟，去沉淀，收集上清液； 

（8）沉淀收集多糖：于上述上清液中加入2～8℃冷却过95%乙醇至最终浓度为：A群按体积分数计为80%；C群、Y群及W135群按体积分数计为75%，充分振摇，待沉淀出现后静置1～2小时；4000rpm离心5分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在-20℃或以下，待纯化；

（9）超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素：将所述步骤（8）得到的多糖粗制品溶解于1／10饱和中性乙酸钠溶液中，A群使其浓度达15～20mg／ml，C群、Y群和W135群使其浓度达10～15mg／ml；用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行超滤,使杂蛋白和内毒素被截留在超滤膜上从而被去除掉，收集超滤液为收获液； 

（10）沉淀精多糖：将步骤（10）收集的收获液中加入95%的乙醇至终浓度为A群按体积分数计为80%，C群、Y群及W135群按体积分数计为75%；充分摇匀，置冷库2～8℃1小时，4000rpm 10分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在-20℃或以下；提取过程在15℃以下进行；用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后0.2μm滤膜完整性试验合格，原液取样后进行检定；

（11）半成品配制：合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含A群、C群、Y群、W135群多糖分别为100.0μg/ml，乳糖为20mg/ml；稀释后立即经0.2μm过滤, 过滤抽样送检，于2～8℃保存；

（12）分装、冻干，制备疫苗成品：上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为0.5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后6小时内冻干；冻 干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送2～8℃冷库保存。