[发明专利]重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的制备方法。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤以及提高机体免疫功能的细胞因子，是机体防御系统的重要组成部分，并且以其作用广泛、残留小等特点，具有广阔的应用前景。天然干扰素产量低、纯化困难，限制了其应用。基因工程手段已经成为生产干扰素的常规方法，出现了许多具有抗病毒活性的基因重组鸡IFN-α表达蛋白。但在研制过程中也发现，由于鸡α-干扰素基因结构比较特殊，用克隆出的全长基因制备的重组表达质粒在大肠杆菌中进行表达，其产量较低，且表达产物的抗病毒活性也不理想，极大地限制了鸡干扰素的制备和应用。因此需要对其制备方法进行更新，更为简便高效地制备出抗病毒活性强的鸡干扰素，为临床应用提供大量安全、高效、新型的抗病毒干扰素，维护养殖业的健康发展。

发明内容

本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供了一种能提高表达物产量、增强抗病毒活性的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的制备方法是，提取鸡脾脏RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用套式PCR的方法，首先用能扩增鸡IFN-α全长基因的外引物进行第一轮扩增，然后用自行设计的内引物扩增相应亚克隆IFN-α1编码基因，得到重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1。

所述外引物参照GenBank中已登录的鸡α-干扰素的基因序列选用。

所述内引物是利用Primer Premier 5.0设计的去除了信号肽及部分非必须片段的内引物，包括上游内引物IFN-αCHA-S2和下游内引物IFN-αCHA-X2，上游内引物IFN-αCHA-S2的序列为：

ACGAATTCATGCCACCTTCTCTCACGAC；

下游内引物IFN-αCHA-X2的序列为：

ACAAGCTTTCAGGTTGTGGATGTGCAGG；

上游内引物IFN-αCHA-S2带有EcoR I酶切位点GAATTC，下游内引物IFN-αCHA-X2带有Hind III酶切位点AAGCTT。

所述的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1的序列是去除了信号肽以及部分非必需片段的编码鸡IFN-α核心片段IFN-α1的基因片段。

纯化后的rIFN-α1的蛋白浓度为0.241mg/ml。

所述的重组鸡IFN-α核心片段rIFN-α1在BHK-21细胞上抗新城疫病毒活性为4.32×10³U.mg^-1。

本发明的制备方法具体包括如下步骤：

1、引物设计合成与目的基因的克隆：参照GenBank中已登陆的鸡α-干扰素的基因序列(登录号为：鸡IFN-α：GGU07868)选择能扩增鸡α-干扰素的外引物，利用Primer Premier 5.0设计去除信号肽及部分非必须片段的上、下游内引物(参见表1)。其中的上游内引物IFN-αCHA-S2带有EcoR I酶切位点(表1中下划线部位)，下游内引物IFN-αCHA-X2带有Hind III酶切位点(表1中下划线部位)。引物由上海生物工程有限公司合成。

表1鸡α-干扰素的外引物和内引物

表1中所示，CHA-S1为鸡IFN-α上游外引物；CHA-X1为鸡IFN-α下游外引物；CHA-S2为鸡IFN-α上游内引物；CHA-X2为鸡IFN-α下游内引物。

提取鸡脾脏总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，先用外引物进行第一轮PCR扩增，PCR扩增步骤为：1、94℃预变性5min，2、94℃变性1min，3、55℃退火1min 40s，4、72℃延伸1min。重复步骤2到步骤4，共30个循环，最后70℃延伸10min。反应体系为：10×缓冲液：20μL，Tag DNA聚合酶(含Mg²⁺)5μL，上游外引物：1μL，下游外引物：1μL，模板：2μL，超纯水21μL，总体积50μL。对PCR扩增产物进行电泳，回收目的片段，分别用相应的内引物进行亚克隆(IFN-α1)扩增，PCR反应步骤同第一轮扩增，PCR扩增产物进行电泳，并回收目的片段。