[发明专利]细胞高富集靶向分离方法

说明书

技术领域：

本发明专利属于一种生物治疗和细胞生物的技术领域，特别涉及一种细胞高富集靶向分离方法。

背景技术：

在生物医学工程关于细胞的科研领域及医学临床应用中，主要目的是研究细胞的功能和作用。例如：脐血干细胞是一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增值的能力，并能在特定因素的影响及诱导下，可以向各种细胞或组织分化。目前，造血干细胞移植已成为最基础的治疗手段，已广泛应用于许多疾病的治疗，包括恶性血液疾病、遗传性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤放化疗后的造血支持治疗等。基于脐血干细胞取材方便，扩增量大，移植成活率高等特点，使其在临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。因此目前国际和国内在临床医院、实验室都在着力开发细胞治疗技术领域，细胞分离技术是提取所需细胞的基础和必要的手段，获取高质量的所需要的细胞，是在细胞治疗中增生所需细胞的一个关键前提和必要保障。如何获得高质量、种类齐全、体积小、活性强的细胞，是分离技术成败的关键。但是目前所采用的分离方法和分离材料都不能有效地获得高质量的、种类齐全、体积微小、活性强的细胞，致使活性年轻细胞回收率和提取细胞存活率低。本专利提供一种全新的高富集靶向分离新技术及专用试剂。

本专利的目的在于克服上述普通分离技术中存在的“活性年轻细胞回收率和提取细胞存活率低”的不足，而提供一种细胞高富集的靶向分离方法及专用试剂，该技术程序简单、便于操作，细胞的回收率：≥95％；细胞的存活率：≥85％，达到国际、国内领先水平。提高了细胞提取精度和效率、节约了分离提取细胞的成本。使其在生物治疗和细胞生物临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。

如上构思，本发明的技术方案是：一种细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

(一)专用试剂的组成和制备：

将氯化钠NaCl、氯化钾KCl、氯化钙CaCl₂·2H₂O和蒸馏水混合配制成标本稀释液A液；将羟乙基淀粉和蒸馏水混合配制成红细胞沉降液B液；将葡聚糖和蒸馏水混合配制成高富集细胞分离液C液；将辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成高富集细胞保存液D液；

(二)分离操作方法步骤：

(1)将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液按照1∶1的比例充分混匀；

(2)将B液全部加入步骤(1)混合后的液体中，放入容器封闭后充分混匀，室温静置20-30min；

(3)室温静止后观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用移液管将上清液移至离心管中，并置于离心机中，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min；或用移液管将上清液移至无菌容器中；

(4)取步骤(3)离心后的离心管，弃上清液，每管加注射用生理盐水混匀，收集离心管中底部的细胞合并到移植离心管中；

(5)取新的离心管，每支加入C液，并将步骤(4)所得细胞悬液或步骤(3)移至无菌容器中的上清液沿离心管壁缓缓加入到装有C液的离心管中，同时保证两液体分界清楚；

(6)将步骤(5)的离心管用离心力720Xg(1200～2000rpm)，离心20-30min；

(7)将步骤(6)离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积≤20ml；

(8)在步骤(7)收集液中加注射用生理盐水充分混匀，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min，弃去上清，收集；再用注射用生理盐水洗涤2次，离心条件同上，收集细胞备用。

在步骤(5)的细胞悬液中加入由辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成的高富集细胞保存液D液并充分混匀，离心力1210Xg(2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集，再用D液洗涤2次，用离心力720Xg(1200～2000rpm)，离心20-30min，收集细胞备用。

上述标本稀释液A液150ml由氯化钠NaCl 4.2g、氯化钾KCl 3.8g、氯化钙CaCl₂·2H₂O4.1g和蒸馏水混合配制成。

上述红细胞沉降液B液150ml由羟乙基淀粉6g和蒸馏水混合配制成。

上述高富集细胞分离液C液100ml由葡聚糖25g和蒸馏水混合配制成。

上述高富集细胞保存液D液150ml由辅酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸馏水混合配制成。

本发明具有如下的优点和积极效果：