[发明专利]细胞高富集靶向分离方法

权利要求书

1.一种细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

(一)专用试剂的组成和制备：

将氯化钠NaCl、氯化钾KCl、氯化钙CaCl₂·2H₂O和蒸馏水混合配制成标本稀释液A液；将羟乙基淀粉和蒸馏水混合配制成红细胞沉降液B液；将葡聚糖和蒸馏水混合配制成高富集细胞分离液C液；将辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成高富集细胞保存液D液；

(二)分离操作方法步骤：

(1)将含有枸椽酸钠或肝素抗凝的骨髓、脐带血、外周血或经血与A液按照1∶1的比例充分混匀；

(2)将B液全部加入步骤(1)混合后的液体中，放入容器封闭后充分混匀，室温静置20-30min；

(3)室温静止后观察有明显的红细胞沉降至最下层时，用移液管将上清液移至离心管中，并置于离心机中，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min；或用移液管将上清液移至无菌容器中；

(4)取步骤(3)离心后的离心管，弃上清液，每管加注射用生理盐水混匀，收集离心管中底部的细胞合并到移植离心管中；

(5)取新的离心管，每支加入C液，并将步骤(4)所得细胞悬液或步骤(3)移至无菌容器中的上清液沿离心管壁缓缓加入到装有C液的离心管中，同时保证两液体分界清楚；

(6)将步骤(5)的离心管用离心力720Xg(1200～2000rpm)，离心20-30min；

(7)将步骤(6)离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，每支离心管中收集液的体积≤20ml；

(8)在步骤(7)收集液中加注射用生理盐水充分混匀，离心力1210Xg(2500rpm)，离心4-5min，弃去上清，收集；再用注射用生理盐水洗涤2次，离心条件同上，收集细胞备用。

2.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：在步骤(6)的细胞悬液中加入由辅酶、三磷酸腺苷和蒸馏水混合配制成的高富集细胞保存液D液并充分混匀，离心力1210Xg(2500rpm)，离心5分钟，弃去上清，收集，再用D液洗涤2次，用离心力720Xg(1200～2000rpm)，离心20-30min，收集细胞备用。

3.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：上述标本稀释液A液150ml由氯化钠NaCl 4.2g、氯化钾KCl 3.8g、氯化钙CaCl₂·2H₂O 4.1g和蒸馏水混合配制成。

4.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：上述红细胞沉降液B液150ml由羟乙基淀粉6g和蒸馏水混合配制成。

5.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：上述高富集细胞分离液C液100ml由葡聚糖25g和蒸馏水混合配制成。

6.根据权利要求1所述的细胞高富集靶向分离方法，其特征在于：上述高富集细胞保存液D液150ml由辅酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸馏水混合配制成。