[发明专利]用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法

说明书

本申请是申请日为2004年11月19日、发明名称为“用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法”的中国发明专利申请No.200480034667.8的分案申请。

相关申请的相互参照

本申请要求2003年11月24日申请的美国临时申请号60/524,511的利益，其全部公开内容在此引入作为参考。

背景技术

在研究或治疗中常常渴望使用富含干细胞的细胞群体。干细胞的典型来源包括骨髓、全外周血、白细胞提取法或单采血液成分术的产物，特别是来自“动员的”供体，或其它较不常见的来源，如脐带血和组织或器官悬液。已经用几种方法进行了干细胞的富集。典型的方法包括密度梯度法(例如胶态二氧化硅等等)、淘洗法、离心、低渗休克造成红细胞裂解和这些方法的各种组合。举例来说，从骨髓纯化干细胞需要除去红细胞和粒细胞，这常常通过密度梯度离心来完成。这些方法中的每一个都有缺点，其中之一是进行富集步骤后需要艰苦的洗涤步骤，例如除去密度梯度离心介质。

富集后，典型地通过重复方法洗涤细胞。该步骤通常包括将富集的细胞悬液放入离心管中和使用离心机使细胞沉淀至管底。从离心机中取出管子，并从沉淀细胞中倾倒出上清液。向管中添加洗液，并重悬细胞沉淀。这些步骤典型地重复2至4次。

这种洗涤方法的一个缺点是连续重悬和离心可降低细胞存活力并增加细胞裂解。离心洗涤的另一个缺点是细菌或其它传染物污染细胞的机会。即使所有的材料保持无菌，离心管的重复开启、吸管和洗液瓶暴露于空气仍可以引起污染。污染风险足够显著，一些医疗管理机构已经要求只有“封闭”系统才能用于细胞操作。

过滤法也已经用于从血液中除去细胞，同时保留其它血液成分用于随后使用。这种方法通常以不可回收的形式将细胞截留于过滤器中，同时允许其它血液成分通过过滤器并进入收集容器。例如，过滤器可以用来从血液中除去白细胞，因此使输血后同种免疫反应的发生率减到最小。白细胞的除去典型地是使用由织结的塑料纤维网制成的过滤器进行的。通常安排该网将白细胞截留于具有足够厚度的网状基质中，使得细胞截留遍及过滤器的厚度，因此保持过滤器不堵塞，因为如果白细胞被截留于平面表面将发生堵塞。

除了细胞的物理截留之外，过滤器的材料和大表面面积允许白细胞不可逆地粘附于表面。这些粘附细胞中的很多正是一些医疗操作中渴望的细胞。所产生的截留和粘附于过滤器的组合建立了用于在输血治疗之前除去白细胞的高效率方法。然而，当白细胞是期望的细胞时，这种过滤方法没有益处。

各种颗粒的分级分离中有用的一种方法是切向流过滤(TFF)或“交叉流”过滤。TFF依靠与多孔膜过滤器表面平行的液体运动。膜的小孔允许液体和典型地小于小孔的液体内的颗粒通过。此外，与过滤器平行的液体交叉流(或“切向”流)防止了大于过滤器表面上小孔的颗粒的集结。

TFF已被用于各种物质的粗分离。Genovesi(J.Parenter.Aci.Technol.，37：81，1983)已综述了切向流过滤在药物领域中的应用，包括无菌注射用水的过滤、溶剂系统的澄清和从肉汤和细菌培养物过滤酶。Marinaccio等(WO 85/03011)报道了用于从血浆除去的血液中除去微粒血液成分的方法，和Robinson等(美国专利5,423,738)描述了使用TFF从血液中除去血浆，允许血细胞和血小板再输注给患者。

在其它用途中，已报道TFF用于啤酒的过滤(EP 0 208 450)，具体而言是用于除去微粒如酵母细胞和其它悬浮固体。Kothe等(美国专利4,644,056)公开了TFF在从奶或初乳中纯化免疫球蛋白中的用途，和Castino(美国专利4,420,398)描述了它在从含有抗病毒物质以及病毒颗粒和细胞的肉汤中分离抗病毒物质如干扰素中的用途。类似地，TFF已经用于从细胞碎片中分离细菌酶。(Quirk等，Enzyme Microb.Technol.，6：201，1984)。此外，切向流过滤装置已经用于悬浮于培养基中的细胞的浓缩。(参见例如Radlett，J；Appl.Chem.Biotechnol.，22：495，1972)。

也已报道了TFF根据大小分离脂质体和脂质颗粒。(Lenk等，美国专利5,948,441)。TFF允许从脂质体和脂质颗粒的异质群体形成和分离具有限定粒度范围的脂质体和脂质颗粒。(参见Lenk等，前述)。