[发明专利]一种辽东楤木原生质体培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种辽东楤木原生质体培养方法。 

背景技术

辽东楤木[Aralia elates(Miq.)Seem]是一种食药兼用型经济植物，主要分布于中国东北地区。辽东楤木的食药用价值较高，其嫩芽含有丰富的营养成分；其植株根、茎、叶等器官均含有多种楤木皂苷，主要皂苷元为齐墩果酸类化合物，可作为生产中药制剂的原料。 

原生质体具有细胞全能性，能够再生细胞壁并进行细胞分裂并再生成完整植株。辽东楤木原生质体的培养可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。目前关于辽东楤木相关报道研究均在外植体再生愈伤组织、植株再生方面，现今尚未见到利用辽东楤木的愈伤组织、叶片等来源的原生质体培养及植株再生的相关报道。 

发明内容

本发明提供一种辽东楤木原生质体培养方法，可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。 

本发明辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤进行：一、取培养20～30天的辽东楤木无菌苗叶片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封，于2～6℃暗处理6～8h；二、再将无菌苗叶片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23～27℃暗处理2～14h，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经240目筛网过滤，再以1500r/min离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到750～900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min离心1min，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤2～3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25℃、60～80r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养13～17天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有1.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的BA和质量浓度3％蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、质量浓度3％蔗糖 和6.5g/L琼脂的MS培养基。 

本发明操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，原生质体的活性为80.5％～87.7％，产量为1.0～3.2×10⁷个/g。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达95％以上。 

本发明着重于探索影响原生质体分离和培养的因素，完善原生质体稳定高效的分离与培养体系，以提高原生质体培养的重复性，使原生质体培养更为简单化和实用化。以此获取的大量高活性原生质体及诱导的愈伤组织可以满足楤木皂苷高产细胞系筛选培育和细胞融合等实验的需要。 

附图说明

图1为具体实施方式二十八得到的原生质体的形态照片；图2为具体实施方式二十八中原生质体培养过程中形成的细胞；图3为具体实施方式二十八中原生质体培养过程中形成的细胞团。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。