[发明专利]一种辽东楤木原生质体培养方法

权利要求书

1.一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于辽东楤木原生质体培养方法，按以下步骤进行：一、取培养20～30天的辽东楤木无菌苗叶片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封，于2～6℃暗处理6～8h；二、再将无菌苗叶片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23～27℃暗处理2～14h，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经240目筛网过滤，再以1500r/min离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到750～900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min离心1min，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤2～3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混匀后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25℃、60～80r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养13～17天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有1.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的BA和质量浓度3％蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、质量浓度3％蔗糖和6.5g/L琼脂的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于3～5℃暗处理。

3.根据权利要求1所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于4℃暗处理。

4.根据权利要求1或2所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中暗处理7h。

5.根据权利要求4所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中于25℃暗处理。

6.根据权利要求5所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理4～12h。

7.根据权利要求5所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理8h。

8.根据权利要求6所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤三中将所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中。

9.根据权利要求8所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中在25℃、70r/min条件下进行暗培养。

10.根据权利要求9所述的一种辽东楤木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中培养15天。