[发明专利]肠道病毒口服基因疫苗及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肠道病毒口服基因疫苗及其制备和应用，具体为利用减毒伤寒沙门菌递送的一种肠道病毒71型VP1基因疫苗和一种柯萨奇病毒A16型VP1基因疫苗及其制备和应用，属于肠道病毒口服基因疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。

背景技术

手足口病严重危害人类尤其是儿童的健康和生命安全，其主要病原是肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CA16)，目前尚无特效的预防和治疗手段。DNA疫苗较传统的减毒活病毒疫苗或者灭活病毒疫苗，省去了病毒筛选、培养、纯化等步骤，仅需获得抗原序列即可批量生产，大大缩短了疫苗生产周期并降低了成本。采用口服减毒伤寒沙门菌递送DNA疫苗的方式，接种方便无痛苦，还省去了疫苗纯化的过程，进一步降低了疫苗生产成本和缩短了疫苗生产周期。

选择合适的目的基因和载体体外连接构建重组质粒，是研究DNA疫苗的关键基础步骤。对所选目的基因的要求是：能够诱导机体产生较强的针对病原抗原的特异性细胞免疫反应。EV71和CA16的基因组只含一个大的开放读码框架(ORF)，编码一个较长的多聚蛋白前体。前体蛋白由病毒编码的蛋白酶切割产生成熟蛋白。该ORF依次分为P1、P2和P3三个区，其中P1区编码病毒的结构蛋白VP1到VP4，组成病毒衣壳，其中和抗原决定簇主要位于衣壳蛋白VP1上。因此以VP1基因为目的基因构建DNA疫苗可获得较强的免疫反应。

减毒伤寒沙门菌是一种细胞内生活菌，通过口服或者鼻黏膜接种后，刺激局部黏膜免疫的同时，大部分减毒伤寒沙门菌还可以穿透过黏膜上皮进入肝、脾等器官并长期生存，直接将DNA疫苗递送于抗原呈提细胞，提高疫苗利用率并长期稳定地诱导系统免疫。重组减毒伤寒沙门菌作为疫苗递送载体，具有制备简便、无需佐剂、接种方便、生物利用率高、免疫原性强且持续时间长等优点。

本发明针对利用减毒伤寒沙门菌递送DNA疫苗的诸多特性和优点，采用现代分子生物学技术和手段对其进行了进一步的研究和改进。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种肠道病毒VP1基因疫苗，以肠道病毒VP1基因为目的基因构建的肠道病毒口服基因疫苗，如以肠道病毒71型(V-EV VP1)和柯萨奇病毒A16型(V-CA VP1)VP1基因为目的基因构建的重组肠道病毒口服基因疫苗。

本发明的第二个目的在于公开一种携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌(SL/V-EV VP1)和一种携带柯萨奇病毒A16型VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌(SL/V-CA VP1)。

本发明的第三个目的在于提供一种携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌和一种携带柯萨奇病毒A16型VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌用于手足口等疾病的预防和治疗。

为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：

一种肠道病毒VP1基因疫苗，其特征在于：其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的肠道病毒VP1基因。

一种优选的技术方案，其特征在于：所述的肠道病毒VP1基因是肠道病毒71型VP1基因(V-EV VP1)。即一种肠道病毒71型VP1基因疫苗，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的肠道病毒71型VP1基因。肠道病毒71型VP1基因的核苷酸序列，如序列表中序列1所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。

一种构建肠道病毒71型VP1基因疫苗(V-EV VP1)的方法，其步骤如下：首先以含有肠道病毒71型VP1基因的质粒pT-EV71-3为模板，用PCR扩增出肠道病毒71型VP1基因序列，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到肠道病毒71型VP1基因疫苗质粒。

一种优选的技术方案，其特征在于：所述的肠道病毒VP1基因是柯萨奇病毒A16型VP1基因(V-CA VP1)。即一种柯萨奇病毒A16型VP1基因疫苗，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的柯萨奇病毒A16型VP1基因。柯萨奇病毒A16型VP1基因的核苷酸序列，如序列表中序列3所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。