[发明专利]用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法

权利要求书

1.用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体，其特征在于由抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体包被，包被比例为5×10⁹个磁小体/100μg抗体，颗粒大小50nm，最小检测Bt杀虫蛋白浓度为1ng/ml。

2.权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于制备磁小体的具体步骤如下：

(1)将湿重25±0.5g冻存的趋磁细菌细胞解冻融化后，悬浮于100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0的缓冲液中，超声振荡破碎10min，超声振荡在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行，

(2)悬浮液离心15min，离心速度为8000转/g，得到的沉淀用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液重新悬浮后，再次超声处理；超声处理在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行，处理10min；

(3)离心后的上清液汇集于烧杯中，置于条形磁铁上1h，吸去非磁性的液体，磁铁吸附的磁小体用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液小心悬浮；

(4)重复上述步骤至少10次，纯化的磁小体用8,000×g离心15min收集，沉淀用10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液悬浮，贮存在-80℃，上述纯化步骤都在4℃下进行：

(5)将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体；

(6)将鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体；

步骤(1)所述趋磁细菌是Magnetospirillum magneticum AMB-1，编号700264。

3.根据权利要求2所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的具体步骤如下：

(1)将Bt杀虫蛋白与弗氏佐剂按体积1∶1混合后，充分乳化，采用背部多点注射法免疫BALB/c小鼠，每次免疫的抗原量为10μg，免疫三次，每次免疫两周后经尾动脉取血检测抗体效价；

(2)以500μg/ml的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；

(3)洗涤后，加入待检的血清样品，100μl/孔，37℃1小时；设阴性对照孔；

(4)洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色15分钟；用2M H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值，通过分析各孔的A490值，检测制备的鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的效价。

4.根据权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于由鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体制备免疫磁小体的具体步骤如下：

(1)用30mM、pH＝5的MES缓冲液在外加磁场作用下清洗纳米磁小体，使纳米磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml；

(2)取纳米磁小体100μl，依次加入50mM EDC、50mM NHS溶液各50μl，室温震荡30min；

(3)在磁感应强度30mT的磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次；

(4)取1.09mg/ml抗Bt杀虫蛋白的多克隆抗体100μl，加入已活化的纳米磁小体，室温震荡30min；

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到免疫磁小体。

5.根据权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于通过羧基-氨基化学偶联法偶联免疫磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的具体步骤如下：

(1)首先用30mM、pH＝5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗免疫磁小体，使免疫磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml；

(2)取100μl免疫磁小体缓冲液，依次加入50m碳化二亚胺、50mN-羟基丁二酰亚胺溶液各50μl，室温震荡30min；

(3)在磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次；

(4)取1.09mg/ml多克隆抗体100μl，加入已活化的免疫磁小体，室温震荡30min；

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体。