[发明专利]肌肉增强子序列及其应用

说明书

技术领域

本发明是关于一种来自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增强子及其应用。

背景技术

基因转殖是现今生物技术领域广泛应用的技术，其是经由遗传工程技术将可表达特定基因产物的核酸分子导入细胞，以修饰其基因表达、给予新的表现性状或作为大量生产特定基因产物的工具。例如，针对牛、羊、猪、鱼、虾等经济动物，可用以改良品种、改良肉质、增加生长率、提高抗病能力及适应力、或提升观赏价值等。以鱼而言，水族产业消费型态由传统蓄养观赏，渐渐提升趋向艺术化、精致化与生活化。而生物科技的发展与创新运用促成了“荧光鱼”的诞生，荧光鱼产业具有技术密集、高附加价值等特性，因此具有庞大的发展潜力与商机。

一般而言，欲使导入细胞的核酸分子在细胞内表达出所欲的基因产物需要适当的启动子序列调控，以达所欲效果，例如，组织专一性表达、诱导性表达、或提升的蛋白质表达量，而增强子序列可再进一步增强启动子活性。以鱼类而言，目前常用于基因转殖荧光观赏鱼的启动子包括来自斑马鱼肌凝蛋白轻炼2(myosin light chain 2，mylz2)的2.2kb启动子。然而，斑马鱼mylz2启动子在斑马鱼种外的其它鱼种和物种的活性仍有改善加强的空间。

因此，在此领域中，仍有需要一种可提升启动子活性的增强子序列，以应用于动物，特别是鱼类的转殖基因技术，。

发明内容

本发明是从斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因分离出一段肌肉增强子序列，其具有明显提高启动子活性的效果，并进一步利用该增强子序列结合启动子制备转殖基因动物(如荧光鱼)，不仅可于不同目(Order)鱼种中应用，亦有应用到其它脊椎动物如哺乳类的肌肉细胞中的潜力，有利于在生物反应器中的应用。

因此，在一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列所组成，其具有增强子的活性。

在另一方面，本发明提供一种重组表达框，其包括：

(a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO：1的核苷酸序列；及

(b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。

根据本发明，该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一具体实例中，该含启动子的核苷酸序列是选自SEQ ID NOS：2至11所组成的群的任一序列。在另一具体实例中，该第一核苷酸片段是选自SEQ ID NO：2、3、12及13所组成的群的任一序列。

在一具体实例中，其中该外源蛋白是荧光蛋白。

在又一方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述重组表达框。

本发明还提供一种宿主细胞，其包括上述表达载体。

本发明亦提供一种制备转殖基因动物的方法，其包括将前述表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞中表达；其中该动物不包含人类。

根据本发明的具体实施例，本发明的方法可用于制备转殖基因鱼，特别是荧光鱼。其是使用显微注射技术将该表达载体导入鱼的受精卵中。其中该鱼是斑马鱼或神仙鱼。

本发明亦提供一种分离的核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS：2至13所组成的群的任一核苷酸序列。

附图说明

上述发明内容及以下具体实施方式与所附图式一并阅读将更增了解。为达阐明本发明的目的，图式中所示具体实例为目前最佳实施方式。然而，应了解本发明并不限于所示的特定排列及结构。

图1为pT2-mylz2-P2.0-AmCyan1载体结构示意图；

图2为pT2-mylz2-P2.0-TcFP-11载体结构示意图；

图3为pT2-mylz2-P2.0-TcFP-13载体结构示意图；

图4为根据本发明的ckmb-P2363片段(-1202/+1161)；由ATG(+1162)转译起始点往前进行选殖2363bp片段，序列中标示重要肌肉生长相关转译因子结合位置；+1为转译起始位置，*为第二个转译起始位置，↓和↑代表1.2kb启动子是列删减位置。下半部阴影部位表示335bp增强子片段；