[发明专利]一种生物蛋白海绵及其制备方法

权利要求书

1.一种生物蛋白海绵，它包括细胞间质、生长因子、凝血因子，其特征在于是以细 胞间质为基质，均匀的添加一定比例的生长因子、凝血因子，通过冷冻干燥技术 制备成海绵状。

2.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述细胞间质由胶原 蛋白、糖蛋白、蛋白多糖组成。

3.根据权利要求2所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述胶原蛋白由I型 和III型胶原蛋白为主的19种其他型胶原蛋白组成。

4.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述生长因子分为： 碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神 经生长因子、结缔组织生长因子、肽类生长因子、转化生长因子、血小板源生 长因子。

5.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述凝血因子分为： 凝血酶因子、纤维蛋白原因子、XIII因子。

6.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述生物蛋白海绵每 平方厘米生长因子、凝血因子的含量为30～300IU。

7.一种生物蛋白海绵的制备方法，采用如下工艺流程：以新鲜哺乳动物的 结缔组织或皮为原料：脱脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒灭活工 序——一次盐析沉淀工序——离心分离工序——二次盐析工序——CM阳离子交 换色谱纯化工序——超滤工序——配制工序—过滤除菌工序—分装工序——冻 干工序——切割工序——内包装工序——二次灭活病毒工序——检验工序—— 成品包装工序——入库。

包括以下步骤：

步骤1、选取原料和脱脂处理：取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进 行脱脂处理；其工艺如下：将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中， 按原料与10～35％碳酸钠溶液1∶1～10的比例，浸泡5～60min，定时搅拌；浸 泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗5～10次；沥净水分， 用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；

步骤2、粉碎工序：先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎， 倒入不锈钢桶中，加入75％乙醇溶液浸泡5～60min捞出，用纯化水反复冲洗5～ 10次，再用注射用水反复冲洗2～5次，沥干；

步骤3、酶解工序：按1kg∶5-30kg的比例加入注射用水混匀，倒入胶体磨 中匀浆；匀浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按1kg原料 加入1～10g胃蛋白酶，酶解温度控制在10℃～35℃之间，搅拌匀浆液PH值为 2.0～4.0时终止，此时酶解液成粘稠、均匀的胶状流体；

步骤4、S/D病毒灭活工序：即脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1∶1～ 10的比例进行稀释、混匀，用孔径为40μm的滤芯进行粗滤，再用孔径为1.0μm 滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入保护剂，达到终浓度为0.5～1.5％，在连 续搅拌的状态下，缓慢加入S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1％，磷 酸三丁酯的浓度为0.3％，搅拌均匀，采用24±1℃病毒灭活6h即可；

步骤5、盐析离心工序：溶液加入1～20倍(W/W)注射用水，混匀，按1∶ 1～5的比例加入饱和氯化钠溶液，搅匀，用连续流离心机10000～17000rpm 离心分离沉淀；取沉淀物加入1～20倍(W/W)注射用水，搅匀，使沉淀溶解 完全，进行二次盐析，再进行离心分离，收集沉淀物；其沉淀物与10～25倍 注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；

步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序：将装有CM阳离子交换树脂的色谱 柱(10×100CM，华美公司)进行平衡，上样速度为3.0～6.0ml/min，然后用 pH＝4.0、浓度为0.3～0.6mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；

步骤7、超滤工序：将收集的细胞间质洗脱液用优选孔径为10kD还可使用 20kD、30kD的超滤器超滤(Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液；

步骤8、配制工序：以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定 比例进行配制，pH值为4.5～7.5；

步骤9、过滤除菌工序：将配制好的溶液依次用孔径为0.45μm和0.22μm滤 芯(PALL)过滤，分装；

步骤10、冻干工序：通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中 的水分去除，采用-20℃～-45℃进行冷冻1～5h，抽真空干燥，20℃～40℃恒温 1～5h；

步骤11、二次灭活病毒工序：将冻干后的产品进行加热灭活病毒，温度为 60～100℃、时间为0.5～144h；

以下工序都在洁净区中进行分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、 成品包装工序、入库。