[发明专利]一种鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学领域；更具体地，本发明涉及一种鸡传染性 法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备和应用。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一种由传染性法氏囊病病 毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的急性、高度接触性传染病，常导 致鸡群的大量死亡，同时导致免疫抑制，使得鸡群疫苗接种免疫失败和继发、 并发疾病大量增加，造成严重的经济损失。该病已成为危害我国养鸡业最严重、 最棘手的传染病，目前没有特效药物治疗。

目前常用的防治手段是疫苗接种，包括减毒疫苗和灭活疫苗，但自IBDV 发现至今，新的变异株、强毒株、超强毒株不断出现，分子结构的改变导致病 毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变，使得传统的疫苗已不能控制其流 行，给疾病的预防与治疗带来新的困难与挑战。近年来，我国养鸡业发展迅速， 特别是规模化养鸡场的增多、养鸡生产水平的提高，每年法氏囊病疫苗的需求 也迅速增长，因此急需开发出一种安全有效的产品，能够在低成本条件下大规 模生产应用，以最快速度预防，控制病毒的传播，从而保障养殖业的健康发展。

随着分子生物学技术的发展，对病毒基因结构与功能的研究深入，传染性 法式囊病病毒基因重组研制日趋成熟，基因工程疫苗已经是国内外发展的主要 方向。综合比较各种基因工程疫苗，其中尤以蛋白亚单位疫苗更具独特的优势。 蛋白亚单位疫苗绝不含活毒成分，生产和使用过程无散毒可能，消除了污染的 可能性，是值得积极推广使用的安全疫苗。

在先专利《200410080065.8，一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的 制备方法和应用》中，亚单位疫苗能够刺激机体产生中和抗体并有效抵抗病毒 的攻击，但是原核表达系统需要对细胞沉淀进行多次冻融超声破碎等繁杂的程 序，以及存在细菌体内可能残留内毒素的危险，在生产工艺流程简化以及疫苗 的安全性方面受到了限制。

在先专利《200510135583.X，鸡传染性法氏囊病病毒VP2cDNA、其表达 载体、所表达的重组蛋白及应用》中，将目的基因VP2进行了人工改造、全基 因序列合成后在酵母中表达。但是，该专利中表达的目的蛋白C端残留有载体 上的一段序列，不具有天然性，且影响了其免疫原性。

因此，仍然需要改良鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备技术， 以提高表达量，获得免疫原性强的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位(VP2)疫苗 的制备和应用。

在本发明的第一方面，提供一种重组表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 亚单位的方法，该方法包括：

(1)提供改造的VP2蛋白亚单位编码基因；其中，在所述的VP2蛋白亚单 位编码基因的5’端起始密码子ATG之前添加蛋白酶KEX2的切割序列，在所 述的VP2蛋白亚单位编码基因的3’端添加终止密码子序列；

(2)将(1)所述的VP2蛋白亚单位编码基因插入到酵母表达载体pPICZαA 的α-factor信号肽编码序列下游，获得重组表达载体；

(3)将(2)的重组表达载体转化毕赤酵母，获得重组的毕赤酵母细胞；

(4)将(3)的重组的毕赤酵母细胞进行重组表达，从表达上清中获得鸡传染 性法氏囊病病毒VP2蛋白亚单位。

在另一优选例中，步骤(1)中，还在所述的蛋白酶KEX2的切割序列的5’ 端之前添加XhoI酶切位点序列；在所述的终止密码子序列的3’端添加NotI 酶切位点序列。

在另一优选例中，步骤(2)中，将所述的VP2蛋白亚单位编码基因插入到 酵母表达载体pPICZαA的XhoI/NotI酶切位点之间。

在另一优选例中，所述的改造的VP2蛋白亚单位编码基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是X-33菌株。

在另一优选例中，将重组表达载体电转化毕赤酵母，电转化条件为：0.2cm 电转杯，电压2.0KV，电击时间5ms，质粒浓度为7-10ug/10μL，感受态细胞 100μL；电转化后快速加入1mL 1M山梨糖醇，30℃复苏1小时。