[发明专利]观察厚组织三维结构的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种用于观察厚组织三维结构的方法，特别是有关利用可增加组织透视程度的技术搭配显微镜影像撷取与组织移除技术，以观察厚组织的三维结构。

背景技术

生物组织的三维结构观察对各种生物的研究有重大义意；在传统技术上观察厚组织三维结构的方法是使用组织切片技术，之后进行染色与影像撷取。通过由浅到深的一系列切片、分别染色与影像撷取后可由影像堆栈方式得到组织的三维影像。然而在任两切片间的机械切除面会产生严重变形与破坏，无法经由堆栈而得到完整且正确的厚组织三维影像。

目前已知较进步的方法是利用光学澄清技术使组织透明化，如使用已揭露的FocusClear技术(参考美国第6472216B1号专利与中国台湾第206390号专利)，可将观察清楚的深度推进到200至300微米(μm)。所谓光学澄清技术是将本来不透明的组织浸泡在可减少光散射的溶液中，因为此类溶液会置换组织中的水份，而且溶液的折射率比水份更接近组织的折射率，因此可减少光的散射，搭配使用共轭焦激光显微镜已可将观察清楚的深度推进到200至300微米(μm)。但是大部分的动物组织与植物组织的厚度却仍远超过此值；举例来说，若脑神经的研究要从果蝇推展到小鼠甚至人体，它的厚度就已超过目前所能清楚观察的范围。如何能找到方法观察厚组织的三维结构便成了急需克服的问题。

发明内容

本发明提出一个方法来克服观察的深度限制：利用可增加组织透视程度的技术，搭配先扫描后移除且移除平面深度小于该阶段最后扫描平面深度的概念，可在扫描过程中使用移除工具移除扫描过的组织，同时也可保留待扫描组织的完整性，如此重复进行扫描与移除的动作可将清楚观察的组织厚度大幅推进，突破显微观察只能限于样品表层薄片的限制。故对于生物科技的发展将带来非常大的帮助。

本发明提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括：提供一厚组织，该厚组织经过光学澄清技术处理，如使用FocusClear(参考美国第6472216B1号专利与中国台湾第206390号专利)技术处理或选用适当波长的光线以穿透该组织，以容许反映其结构的光信号穿透该厚组织而可被显微镜撷取；一光学扫描显微镜与一组织移除装置。该厚组织包含动物组织、植物组织、人造组织或生物材料，该组织经包埋固定后，置于一基座之上。所使用的光学扫描显微镜包含共轭焦激光显微镜、多光子激光扫描显微镜等可撷取特定光学切片的光学显微镜。所使用移除装置的移除方法包含机械式切除、激光切除或化学腐蚀、烧灼等方法。

以该光学扫描显微镜自该厚组织表面开始撷取组织的影像，之后渐次增加该影像撷取装置的影像撷取深度，以撷取组织表面以下各深度平面的影像。此处的撷取深度乃相对于光学扫描显微镜的物镜而言，愈远离物镜处为深度愈深。由于形成组织深层影像的光信号受到其上层组织散射的影响，组织渐深处影像分辨率渐差。当扫描至影像清楚的极限时，将移除平面定于其扫描平面上方某特定距离，然后去除移除平面以上的组织。此处影像清楚的极限乃根据使用者需求的影像分辨率而定，扫描平面上方的特定距离亦根据使用者需求作调整，唯组织去除深度必须小于组织已扫描深度，使去除面产生的变形及破坏不影响待扫描组织的完整性，可维持后续扫描所撷取的组织影像与已扫描组织影像的连续性。若重复扫描移除平面与已扫描平面间的区域，可作为后续影像重组的对齐依据。

执行多次上述扫描、撷取影像与使用该移除装置移除厚组织移除平面上方组织的动作，即可撷取该厚组织全部深度的三维结构影像，以供后续重组该各层影像以建构成该厚组织的三维结构影像。

本发明还提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括；

提供一待扫描的厚组织，其中该厚组织容许反映其结构的信号穿透；

提供一光学扫描显微镜，用以撷取该厚组织的影像；

提供一移除装置，用以移除部分该厚组织；

执行以下步骤多次，以撷取完整的该厚组织的三维影像：

以该光学扫描显微镜自该厚组织的表面撷取该厚组织的影像，之后渐次增加该光学扫描显微镜的取像深度，以撷取该厚组织表面以下各深度平面的影像；

以该光学扫描显微镜所撷取的各深度平面的影像清晰度决定出距离该厚组织表面的一扫描深度；

在该扫描深度上方的一特定距离决定出一移除平面；

以该移除装置移除该移除平面以上的该厚组织后，继续撷取该厚组织更深层的影像。

上述观察厚组织三维结构的方法，先执行撷取影像后再移除该厚组织，且该移除平面的深度小于该扫描深度。

本发明还提供一种观察厚组织三维结构的方法，包括：