[发明专利]铁皮石斛的杂交育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种珍稀药用植物种苗繁殖方法，具体地说，涉及一种铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的杂交育种和种苗繁殖方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)又叫黑节草、铁皮兰等，为兰科多年生附生草本植物，主要分布于秦岭和长江流域以南地区，并且主要集中在山区中的树荫下或石缝中。铁皮石斛是我国常用的名贵中药，具有独特的药用价值，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效。现代药理研究表明，铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管的作用。但由于人们对铁皮石斛的过度采挖而使野生资源枯竭，现铁皮石斛已成为国家重点保护的药材品种之一。

由于铁皮石斛分布范围较广，并且各个分布区中又相对比较集中，加上铁皮石斛主要以无性方式进行繁殖，造成铁皮石斛在种内形成了许多地域性种群。加强不同种群之间的优势互补，实现杂交优势技术在铁皮石斛中的应用对解决缺乏优质铁皮石斛种苗的现状具有重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供出一种萌发率高、成苗快、种苗品质好的高效率的铁皮石斛杂交育种的方法。

本发明人通过将选好的两种铁皮石斛杂交亲本进行人工授粉，得到的果实在基本成熟而未开裂时在种子萌发培养基上进行无菌播种，种子萌发后再转移到壮苗培养基上培养，形成的试管苗经过自然光照下炼苗后出瓶栽培，试管苗移栽成活率达到95％以上，由于靠本发明人利用了培养基上培养出壮苗，经长期摸索终于找到适合壮苗培养基作为发明点，从而实现了本发明的目的。

本发明的铁皮石斛杂交育种方法，其特征在于包括以下的步骤：

(1)人工授粉：选定用于杂交的两种铁皮石斛亲本，采集父本的花粉授于母本的柱头上，两个亲本互为父、母本进行正反交；

(2)无菌播种：当铁皮石斛杂交种授粉后，在果实发育基本成熟而果实未开裂时，将该果实作为外植体用70％-80％酒精消毒20-60秒后，用无菌水冲洗2-5次后置于0.1％-0.2％的升汞中消毒15-30分钟，再用无菌水漂洗4-6次后切开果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基上培养，所述的种子萌发培养基每升含蛋白胨0.5-4g，椰子汁50-150ml，蔗糖15-30g，琼脂3.5-5g，肌醇40-100mg，盐酸硫胺4.5-12mg，甘氨酸1.5-4.0mg，烟酸1.0-2.5mg，D-泛酸钙0.9-2.5mg，抗坏血酸0.8-2.0mg，吡哆辛盐酸0.4-1.5mg，生物素0.09-0.25mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分；

(3)壮苗培养：将无菌播种获得的小植株接种到壮苗培养基上培养，所述的壮苗培养基每升含蛋白胨0.5-3g，水解酪蛋白0.1-0.5g，蔗糖15-30g，琼脂3.5-5g，α-萘乙酸0.5-3.0mg，肌醇40-100mg，盐酸硫胺4.5-12mg，甘氨酸1.5-4.0mg，烟酸1.0-2.5mg，D-泛酸钙0.9-2.5mg，抗坏血酸0.8-2.0mg，吡哆辛盐酸0.4-1.5mg，生物素0.09-0.25mg，香蕉匀浆50-150g，胡萝卜汁10-50g，苹果汁10-50g，马铃薯汁10-50g，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分；

(4)试管苗移栽：当小植株形成的植株长至4-6厘米时，将培养瓶转移到自然光下炼苗7-14天，然后将其从组培瓶中取出，洗净根部的培养基，移至水苔或泥炭和兰石按体积比1∶1的混合基质中栽培，得到种苗；

在上述(2)-(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～5.8，培养温度28～30℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000lx。

在上述人工授粉步骤中，如果选定用于杂交的两种铁皮石斛亲本同时开花，可在花朵展开后3-5天内进行人工授粉，授粉选择在16:00～17:30进行，授粉前先去除母本和父本的唇瓣，去除父本的药帽，将父本的花粉粒授于母本的柱头窝内，两个亲本可互为父、母本进行正反交；

如果所选定的两个亲本不在同一时间开花时，则可以先开花的铁皮石斛亲本为父本，后开花的铁皮石斛亲本为母本，先采集父本的花粉用密封消毒的塑料管室温保存，铁皮石斛花粉保存时间可达1-3个月，当母本铁皮石斛开花3-5天后，将有生命力的花粉授于母本的柱头窝内，花粉的生命力可采用氯化三苯四氮唑染色法测定。

大部分铁皮石斛在授粉后110-150天杂交果实成熟，一般铁皮石斛杂交种子最佳的萌发期是在果实发育基本成熟而果实未开裂时。