[发明专利]一种甘菊繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及甘菊离体培养和植株再生的方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)又名岩香菊，甘野菊，为菊科菊属甘菊系多年生草本植物，是菊花(Chrysanthemum×morifolium)起源的重要亲本之一，具有较好的观赏价值，属于野生观赏植物。其分布于我国多个省市，多生于海拔630-2300米的山坡、岩石、河谷、河岸、荒地以及黄土丘陵地区。

甘菊是一种较好的节水野生地被植物材料，具有抗逆性强、适用范围广、管理粗放等优点，适于山坡绿色、公路护坡、河堤种植，可防止水土流失；也可用于公园、庭院，增加景观的野趣性；可与郊野绿地及植物配景，可形成艳丽的缀花草坪，可给园林增添许多生机。此外，甘菊为菊属植物中的二倍体植物，倍性较低，是栽培菊花起源中参与起源且遗传背景最为简单的菊属野生植物，适合用作菊科植物遗传育种研究的模式植物。

目前人们已经针对甘菊做了不少研究工作，其中包括甘菊栽培繁殖技术，再生及转化体系，花发育基因的克隆、表达及功能验证和抗逆性等多方面的研究，这些研究为将甘菊作为菊科植物研究的模式植物奠定了基础。例如刘占磊等人在2009年14期《安徽农业科学》上发表的甘菊遗传转化再生体系的建立，以甘菊无菌苗叶片为外植体，通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系，在芽诱导培养基中添加0.1mg/L的NAA和0.1mg/L 6-BA时再生频率最高，可达98％，其不定芽生根率可达100％，该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。又如北京林业大学的丁焱等人在2005年《中国观赏园艺研究进展》上发表的甘菊再生体系的建立，以甘菊无菌苗叶片为外植体，诱导植株再生，建立再生体系，结果表明甘菊种子用0.8％次氯酸钠溶液20分钟效果最好；切茎增殖用1/2MS+0.5％活性炭最好；诱导叶盘愈伤和分化采用MS+1mg/L6-BA+0.2mg/L NAA最为迅速；生根培养中采用1/2MS+0.1％NAA效果更好，生根的小苗在温室里生长良好。

稳定的再生体系和遗传转化体系是对甘菊进行转基因工作和分子遗传学分析的基础。通常，一个稳定、高效的再生体系必须具备以下条件：(1)外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力；(2)具有较高的芽分化率；(3)易于离体培养，具有高度可重复性；(4)体细胞无性系统变异小。虽然对甘菊再生体系的研究较多，但是迄今为止，甘菊稳定的再生体系始终未获得。现有技术中以甘菊的叶片作为外植体虽然能够建立甘菊的再生体系，但其再生时间较长，愈伤组织诱导率以及不定芽的分化率低，再生体系不够稳定，重复及再现性差，从而不利于甘菊的规模化、工厂化生产及培育。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种愈伤组织诱导率高、不定芽分化率高、生根率高及稳定的甘菊离体培养再生体系的建立方法。该方法可以在较短时间内形成大量优良的甘菊试管苗，可进行规模化、工厂化生产，可用于甘菊转化体系研究，也可以用于分子育种研究。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种甘菊繁殖的方法，包括以下步骤：

1)将甘菊种子接种于种子萌发培养基上进行无菌幼苗培养，萌生为无菌幼苗；

2)将无菌幼苗的下胚轴作为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，诱导生成愈伤组织；

3)将诱导生成的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导分化培养，培养得到不定芽；

4)将不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，诱导培养不定根，获得生根苗；

5)将生根苗进行炼苗、移栽，即得。

其中，所述步骤1)中所述的种子萌发培养基是MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6.18。

特别是，步骤1)中所述无菌幼苗为由种子萌发的子叶完全张开，真叶尚未展开的幼苗。

其中，所述无菌幼苗的下胚轴长度为12-17mm。

特别是，所述下胚轴为无菌幼苗子叶着生处到根尖的一端胚轴。

其中，所述步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基是：MS基本培养基+2，4-二氯苯氧基乙酸0.5-1.5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6.18。

特别是，步骤2)中所述2，4-二氯苯氧基乙酸优选为1mg/L，6-苄氨基腺嘌呤优选为0.5mg/L。