[发明专利]cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法。

背景技术

从生物个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及到基因的选择性表达。不同细胞间或同一细胞不同时间与空间，基因表达的差异决定着生命活动的多样性。基因在时间和空间上的有序表达贯穿和调控了个体的整个生命过程。高等生物大约有几万个不同的基因，在一定时间、空间中，任何一个细胞中仅有10％～15％的基因表达，并受到严格调控。这种在不同细胞间或同一细胞中，基因按时间和空间顺序选择性地、有序地进行表达，称为基因的差别性表达。基因的差别性表达有两种方式，分别为新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制。由于细胞的各种生理过程或病理改变在本质上都是由基因表达的改变所决定的。因此，通过比较不同细胞或同一类细胞不同生理条件下、不同生长发育阶段的基因表达的差异，将为分析整个细胞的生命过程提供有用的信息。一旦获取差异表达的基因将有助于了解正常生理变化和病理改变的分子机制，为基因诊断、基因治疗和发现新的药物靶点提供新的视角。因此，分离和克隆差异表达基因成为分子生物学研究的一个努力方向。近年来，分离差异表达基因的技术不断发展与完善，目前这些方法已得到广泛应用，并已成功分离了许多差异表达的基因。

肌内脂肪的形成是一个渐进的过程，在个体发育的不同时期其性状的表现也会有所不同。从根本上讲，在日龄和环境条件基本一致的情况下，肌内脂肪的沉积的变化是由控制肌内脂肪沉积的基因在不同的表达所决定的。Anderson等(1973)认为，猪脂肪组织的增长在前1～2个月主要是脂肪细胞数目的增加，在2-5月龄是脂肪细胞数目增加和脂肪细胞体积增大共存，5～6月龄以后的发育主要为脂肪细胞体积的增大。在不同类型的猪肌肉中的研究发现，脂肪型猪和瘦肉型猪脂肪细胞的增殖和肥大能力均存在显著差异，前者脂肪细胞成熟的速度较慢而后者脂肪细胞成熟的速度较快，表明脂肪细胞在不同品种间的成熟速度有明显的差异，这种差异也可能是导致肌内脂肪沉积速度差异的一个重要原因。

在动物细胞里，80％以上的能量是在线粒体中合成的。糖和脂肪等营养物质经酵解和三羧酸循环后脱下的氢经线粒体内膜上的电子传递系统即呼吸链，最后传递给氧。呼吸链中的复合物I即NADH脱氢酶是最复杂的酶系，其作用是催化NADH的2个电子传递至辅酶Q。

还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶，其分子量为770.8kDa，等电点为3.0。NADH在生化过程中起电子传递作用，能量反应中的电子，通常都先被传递至NAD，再还原成NADH，经过传递链传递电子至氧，并释放能量，氧化磷酸化作用便利用这些能量制造ATP，1分子NADH还原产生3分子ATP。它在生物体内的糖酵解、柠檬酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重要作用。NADH对活化生物体内多酶系统，促进核酸、蛋白、多糖的合成和代谢，增加物质转运和调控，改善代谢功能等具有重要的作用，同时NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢中也起重要作用。细胞内NADH含量的升高，使脂肪酸氧化减弱。同时NADH含量升高又促进脂肪酸的合成。

随着年龄的增长，组织器官日趋老化，从能量供应充足的状态到能量供应不足，组织器官出现其功能异常，特别是大脑中枢神经系统中神经细胞功能退化，如帕金森氏综合征，阿尔海姆茨病等，并导致全身性疾病发生，如疲劳综合征。研究表明NADH能增加内源性多巴胺合成和改善帕金森氏综合征症状，预防帕金森氏综合征黑质变性过程和促进神经细胞存活分化。NADH不仅是一种重要的生化试剂，同时也可能作为一种生化药物发挥细胞保护作用。

cDNA-AFLP技术是Bachem等发明的。该技术是将AFLP技术应用于mRNA表达差异分析基础上发展的一种mRNA指纹图谱技术。该技术保留了AFLP技术的可靠性与高效性，可广泛地应用于动植物差异基因的分离及鉴定。cDNA-AFLP在cDNA酶切片段两端加上统一的接头作为PCR扩增的模板，使经典PCR反应的可靠性大为提高。Habu等比较了DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术扩增结果，重复性可达100％。Fukuda等的试验也证实cDNA-AFLP分析再现性达95％以上。本试验研究中发现由引物扩增出的差异表达片断均可重复出现，即使是不同个体的材料也能扩增得到相同的差异片段，从而也证实该试验方法的重复性好及可靠性高的特点。