[发明专利]cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法

权利要求书

1.利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于苏太商品猪屠宰后采取背最长肌，根据肌内脂肪的含量从中选取最高和最低各5头以上构建RNA池，提取肌内脂肪部位的总RNA，以总RNA为模板合成双链cDNA，用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段两端与相应的限制性内切酶人工接头序列连接后，利用与所述的限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物进行预扩增，再以预扩增产物为模板进行选择性扩增，选择性扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得脂肪含量差异表达基因的差异片段。

2.根据权利要求1所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的识别序列为6bp的限制性内切酶为EcoR I限制性内切酶，所述的识别序列为6bp的限制性内切酶为Taq I限制性内切酶。

3.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的EcoR I接头序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，Taq I接头序列接头序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

4.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的与EcoR I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ IDNo.5，与Taq I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ ID No.6。

5.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的选择性扩增引物一条为EcoRI选择性引物，另一条为TaqI选择性引物。

6.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的EcoRI选择性引物选自E1：SEQ ID No.7，E2：SEQ ID No.8，E3：SEQ ID No.9，E4：SEQ ID No.10，E5：SEQ ID No.11，E6：SEQ ID No.12，E7：SEQ ID No.13，E8：SEQ ID No.14，E9：SEQ ID No.15中的任意一条；所述的TaqI选择性引物选自T1：SEQ ID No.16，T2：SEQ ID No.17，T3：SEQ ID No.18，T4：SEQ ID No.19，T5：SEQ ID No.20，T6：SEQ ID No.21，T7：SEQ ID No.22，T8：SEQ ID No.23；共形成72种选择性扩增引物对组合。

7.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的选择性扩增PCR反应程序如下：94℃ 4min；[94℃ 30s，65℃ 1min(每个循环降低0.7℃)，72℃ 1min]×12；(94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×25；72℃ 7min。

8.根据权利要求1～7中任意一条所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法还包括回收差异片段，进行克隆及测序。