[发明专利]结核杆菌耐药蛋白的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及耐药蛋白的筛选领域，具体涉及一种结核杆菌耐药蛋白的筛 选方法。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)简称为结核杆菌(tubercle bacilli)。 早在1882年，德国细菌学家郭霍(Robert Koch，1843-1910)就已证明 结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺 部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结 核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病 和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人 口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全 世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家 成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％～10％携带者可发展为 活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆 菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可 能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在 HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加 重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年 约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。我国每年死于结核 病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核 病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和 地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

在固体培养基中对常用的含异烟肼1g、链霉素10g、利福平50g能 生长的结核杆菌为结核杆菌耐药菌，不能生长的结核杆菌为结核杆菌敏 感菌。耐药菌株毒力有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝菌酸的合成， 诱导结核杆菌成为L型，此可能是其耐异烟肼的一种原因。药物敏感试 验表明对异烟肼耐药，而对利福平和链霉素大多仍敏感。故目前治疗多 主张异烟肼和利福平或吡嗪酰胺联合用药，以减少耐药性的产生，增强 疗效。

如能筛选出对目前治疗肺炎和结核病的常用药物异烟肼(INH)、链 霉素(SM)、利福平(RFP)和乙胺丁醇(EMB)具有耐药性的结核杆 菌耐药菌株的耐药蛋白，将能迅速寻找病原菌的致病因子，研究相应的 新型药物，降低药物的耐药性，提高病人的痊愈率。

发明内容

本发明提供了一种结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，能够全面筛选对目前 常用结核病用药具有耐药性的结核杆菌耐药蛋白。

一种结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，包括以下步骤：

(1)选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株；

所述的药物为异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇中的一种或多种；

(2)将结核杆菌菌株于100℃沸水煮10分钟，灭活，收集菌液，冻于 -80℃备用；

(3)从菌液中提取蛋白，采用凝胶电泳法分离蛋白，进行胶内酶解， 对蛋白测序后提取肽段；

(4)将肽段采用液相色谱分离后进行质谱分析，将质谱结果与现有的 蛋白质谱数据进行对比分析，筛选出结核杆菌耐药蛋白。

步骤(1)中，选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株的方 法，可采用现有的加药培养方法进行培养得到。

为了达到更好的发明效果，优选：

步骤(3)中，所述的凝胶电泳法为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳法(SDS-PAGE凝胶电泳法)。

步骤(3)中，所述的胶内酶解的方法包括步骤：