[发明专利]结核杆菌耐药蛋白的筛选方法

权利要求书

1.一种结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，包括以下步骤：

(1)选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株；

所述的药物为异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇中的一种或多种；

(2)将结核杆菌菌株于100℃沸水煮10分钟，灭活，收集菌液，冻于 -80℃备用；

(3)从菌液中提取蛋白，采用凝胶电泳法分离蛋白，进行胶内酶解， 对蛋白测序后提取肽段；

(4)将肽段采用液相色谱分离后进行质谱分析，将质谱结果与现有的 蛋白数据库进行对比分析，筛选出结核杆菌耐药蛋白。

2.根据权利要求1所述的结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，其特征在于， 步骤(3)中，所述的凝胶电泳法为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

3.根据权利要求1所述的结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，其特征在于， 步骤(3)中，所述的胶内酶解的方法包括步骤：

将凝胶电泳法所得的蛋白胶带从上到下根据蛋白情况切成若干个条带， 再剪成胶粒，200ml脱色液完全脱至无色，分离所得胶粒使用终浓度为50 mmol/L的三羧乙基磷水溶液在60℃水浴还原10分钟，再进行半胱氨酸烷基 化使用吲哚-3-乙酸避光条件室温孵育1小时，分离所得胶粒加200ul脱色液 洗两次，每次15分钟，然后往胶粒中加入50ul乙腈，室温放置15分钟，弃 去乙腈，离心旋干，旋干后的胶粒加入10ul测序级胰蛋白酶溶液，胶粒在测 序级胰蛋白酶溶液中室温孵育15分钟，加入20ul的25mmol/LNH₄HCO₃缓 冲液，37℃水浴中振荡过夜，酶解18小时以上，胰酶酶解后的胶粒每次加 入50ul肽段提取液，室温孵育30分钟，提取肽段，重复3次，将提取的肽 段溶液合并，离心旋干，干粉在-80℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，其特征在于， 所述的脱色液为乙腈-碳酸氢铵水溶液，其中乙腈体积百分浓度为50％，碳 酸氢铵浓度为25mmol/L。

5.根据权利要求3所述的结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，其特征在于， 所述的测序级胰蛋白酶溶液的配制方法为：胰蛋白酶用25mmol/L NH₄HCO₃缓冲液溶解，配制成胰蛋白酶浓度为1ug/ul的母液，使用时按照胰蛋白酶与 蛋白质量比为1∶50，用25mmol/L NH₄HCO₃缓冲液稀释至所需的浓度。

6.根据权利要求3所述的结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，其特征在于， 所述的肽段提取液为乙腈体积百分浓度为50％和甲酸体积百分浓度为5％的 乙腈-甲酸水溶液。