[发明专利]一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别是涉及分子识别的探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度。 

背景技术

1990年Henry等提出了免疫传感器的概念，免疫传感器利用抗原、抗体作为分子识别原件，把抗原-抗体特异性反应过程中产生的信号通过换能器转变成电信号，从而对被测物进行定量分析。与传统的检测技术相比较，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、分析速度快、价格低廉等优势，且易于实现自动化操作，在临床诊断、医疗保健、环境监测、食品安全等领域显示出良好的应用前景。然而已报道的电化学安培传感器在使用中也存在以下不足：①多采用“一步法”即采用抗原抗体结合后形成的免疫复合物导致电极表面电流下降，根据下降电流来进行定量，这样就不可避免的难以克服非特异性吸附的影响；②当电极表面的抗原/抗体发生免疫结合后生成物很难除去，电极无法更新，使用多为一次性；③尽管安培免疫传感器有诸多优点，但是面对背景非常复杂的具体检测对象(如血清样品)，往往需通过一定的样品提纯处理后再进行检测，影响了其易用性。所以，上述问题在一定程度上限制了免疫传感器的优势。 

近年来，基于夹心免疫的纳米修饰电化学传感器由于其卓越的灵敏度引起人们的广泛关注。由于夹心免疫传感器与“一步法”传感器相比具有较高的敏感性和特异性，制备此类传感器最关键的就在于对二抗的富集。已经有报道采用多种纳米材料对二抗进行富集，如碳纳米球、二氧化硅、纳米Pt、二氧化锰、石墨烯(GS)、碳纳米管(CNTs)、纳米金(nano-Au)、量子点等。然而这些富集过程繁琐，需要离心才能分离探针和未结合抗体；有研究使用磁性纳米材料(如四氧化三铁、金磁纳米颗粒)等富集抗体，避免了繁琐的离心过程，但是其合成的磁性材料容易团聚，稳定性差，且单个纳米颗粒对抗体的富集效果有限。袁若等报道了通过抗坏血酸的还原作用形成一种“链状金线”，由多个纳米金原子形成串珠状，由此可大量富集抗体，但是此“链状金线”的合成过程至少需要5天时间，且无磁性，依然需要通过离心来进行分离，探针的分离过程繁琐。因此研发一种新的具有分离简便、富集率高的抗体富集材料并应用到电化学免疫传感器中具有重要的意义。 

ZrO₂作为一种Lewis强酸，通过与蛋白分子上的羧酸和DNA上的磷酸等基团(Lewis强碱)特异性取向结合，可被直接用来固定酶及抗体。由于抗体和酶包被在极细(1～2μm)且表面积很大的纳米ZrO₂上，标记量显著增加且能较长时间地保持生物活性。但是单个纳米颗粒 对二抗抗体的富集效果有限。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种二抗探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度，且具有富集抗体效果优异和检测限低的优点。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，该探针由小牛胸腺DNA分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。 

本发明所述的二抗探针，其中所述的磁性纳米颗粒为公知材料，具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的发明专利申请所述方案进行。 

本发明所述的二抗探针的制备方法由以下步骤组成： 

1)将磁性纳米颗粒加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为磁性纳米粒子0.1倍的辣根过氧化物酶标记抗体，4℃下反应6h，分离得到负载抗体的纳米微球； 

2)将所得到的纳米微球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为所述纳米微球0.1倍的过氧化物酶和重量为所述纳米微球1.0倍的牛血清白蛋白，4℃下反应6h，分离得到纳米球； 

3)将纳米球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为纳米球1.2倍的小牛胸腺DNA，室温下反应6h，分离得到二抗探针。