[发明专利]一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法，尤其是一种以萘酰亚胺类化合物为荧光探针的相邻巯基蛋白质的原位荧光检测方法。

背景技术

细胞内氧化还原环境的变化深刻地影响着细胞内各种生理功能。相邻巯基蛋白质，作为氧化还原平衡中还原端的顶点，密切参与各类氧化还原的调节，在酶活性的调节、细胞信号传导、疾病发生进程等方面起着非常重要的作用。由于蛋白质的巯基修饰基本没有光谱学特性，无法直接测量，而一般的检测手段常常需要破坏细胞再通过化学方法检测，通常无法得到相邻巯基蛋白在细胞内分布的信息。而细胞结构的破坏会导致细胞内各细胞器氧化还原环境，以及各种与相邻巯基相关酶类的重新分布。荧光成像可以提供大量直观，动态的信息，是进行生命科学研究的主要手段之一。

钱永健等基于相邻巯基与三价砷特异性结合的特点设计合成出了用于双砷荧光探针FLAsH及其类似物(Science 1998，281，269-272；US 6008278)，但是该类探针只用于发展一种蛋白质标记策略，涉及到的相邻巯基蛋白是通过外源性导入的多肽链，内源性的细胞中的相邻巯基蛋白反而被外加的一定浓度的EDT给抑制住。

Ebright，R.H.等发展一类基于内源性相邻巯基蛋白的双砷探针(US20040019104，US20060141531)，该类探针虽然可以同细胞内内源性的相邻巯基蛋白作用，但是该类探针也只用于发展一种蛋白质标记策略，并非将该类探针用于检测相邻巯基蛋白以及与之密切相关的氧化还原信号转导和氧化还原蛋白质组学研究。同时，该类探针上连接了两个砷基团，在化学计量学上并不能同单一的一个含相邻巯基的蛋白结合，容易在同一个探针分子上连接上不同种类的相邻巯基蛋白。因此，以上两类探针只注重于发展一种蛋白质标记策略，并不能用于原位检测内源性的相邻巯基蛋白。

因此，设计合成特异性的相邻巯基蛋白质小分子荧光探针，发展蛋白质相邻巯基的原位荧光成像技术及相关蛋白质组技术，对系统性地研究与揭示蛋白质巯基氧化还原状态在信号转导这一与许多重要疾病相关的重大生命科学领域中的功能与作用具有重要意义，是目前十分迫切的任务。

发明内容

本发明设计合成了一类特异性原位检测蛋白质相邻巯基的化合物，建立了一种原位荧光标记检测生物体内蛋白质相邻巯基的方法。

本发明提供下式II化合物：

式中，

m为1、2或3；

R选自NH₂或NHC(O)R¹；

R¹选自-R³-NHR²或-R³-COOH；

R²选自H和氨基保护基；

R³为C_1-12烷基。

在一具体实施例中，m为1。

在一具体实施例中，R为NH₂。

在一具体实施例中，R¹为C_3-8烷基-NHR²。

在一具体实施例中，R¹为C_3-8烷基-COOH。

在一具体实施例中，R²为H。

在一具体实施例中，R²为-C(O)O-C_1-6烷基。

“保护基”在本文中指一种原子基团，当连接至分子中的反应性官能基时，遮蔽、减少或防止官能基的反应性。典型地，保护基如需要可在合成期间选择性除去。保护基的例子可见Greene和Wuts的《有机化学中的保护基》(第3版，1999，约翰维斯父子出版社，纽约)和Harrison等人的《合成有机方法之大纲》(第1-8册，1971-1996，约翰维斯父子出版社，纽约)。代表性氨基保护基包括(但不限制于)甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲基、苯甲氧羰基(“CBZ”)、叔丁氧羰基(“Boc”)、三甲基甲硅烷基(“TMS”)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“TES”)、三苯甲基和取代的三苯甲基、烯丙氧羰基、9-芴基甲氧羰基(“FMOC”)、硝基蔾芦氧羰基(“NVOC”)等。

在一具体实施例中，所述氨基保护基选自Boc₂O、苄基、Fmoc、乙酰基(Ac-)、磺酰基、苄氧羰基(Cbz)。

本发明也涉及上述式II化合物在制备荧光探针中的应用。