[发明专利]一种耳蜗大上皮嵴细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞系构建领域，特别涉及一种耳蜗大上皮嵴细胞系及其应用。

背景技术

耳聋是人类发病率最高的感官或功能缺陷性疾病，不仅严重影响患病人群的生活、学习、社会交往及家庭生活品质，而且给患者及其家庭带来生理上和心理上痛苦。耳聋分为传导性耳聋、感音神经性耳聋及混合性耳聋。我国卫生部2000年公布的调查结果显示，感音神经性聋约占耳聋患者的63％，其绝对数量超过8千万。目前，感音神经性聋的治疗多需要借助人工耳蜗。人工耳蜗植入及助听技术的临床应用部分改善了中重度感音神经性聋患者的听力障碍，一定程度上改善了患者的言语交流能力。但是人工耳蜗植入价格昂贵，限制了该技术在耳聋治疗中的广泛应用。

研究表明，噪音、耳毒性药物、感染、中毒、老化以及各种疾病引起的毛细胞的缺失、变性和损伤是导致感音神经性耳聋的主要原因。毛细胞是内耳感觉上皮的终末分化细胞，当声波经过的时候，从细胞表面长出的静纤毛随声波运动，把刺激经由神经传给大脑。但是哺乳动物的毛细胞损伤后不能再生，因此，使毛细胞再生或恢复，成为治疗由毛细胞损伤所致的感音神经性聋的关键。但是耳蜗毛细胞为分化的终末细胞，不能传代，因此在体外不能培养，建立能够传代的细胞系更为困难。

近年来，研究发现，位于感觉上皮外的大上皮嵴细胞经诱导能形成大量新生毛细胞，且当耳蜗组织过表达Math1后，会诱导大上皮嵴细胞区域产生异位毛细胞，即大上皮嵴柱状上皮细胞在Math1的作用下能分化成毛细胞。这些研究表明大上皮嵴细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞之一。但是由于内耳中小的组织、复杂的体内骨结构以及缺乏由毛细胞的祖细胞构成的培养体系，获取大量此种耳蜗毛细胞的前体细胞非常困难。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系。该大上皮嵴细胞系能够稳定传代，可应用于毛细胞分化、再生的研究及制备治疗耳聋的相关药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系，含有Math1基因，保藏编号为CGMCC No.4719。

哺乳动物内耳的形态生成和毛细胞的产生是由局部的细胞间相互影响及特异的基因调控的，其中最关键的就是“碱性螺旋-环-螺旋”(basic helix-loop-helix，bHLH)基因转录调控因子，如Math1(mammalian atonal homologl)是毛细胞分化的正向调控因子。Math1是一种果蝇atonal的鼠类同源基因，对于毛细胞分化是必须的。发育中的毛细胞表达Math1，而非感觉细胞则不表达。试验证明，Math1基因敲除后鼠无法形成毛细胞，新生鼠内耳组织培养物过表达Math1会引起大上皮嵴(greater epitheliaridge，GER)区域额外毛细胞的产生。通过腺病毒载体转染Math1基因至成熟豚鼠耳蜗内淋巴囊从而构建Math1在耳蜗非感觉细胞的过表达模型，结果显示Corti器、内沟细胞以及Hense细胞区域产生了不成熟毛细胞，并且听觉神经轴突伸向一部分的新生毛细胞，说明新生毛细胞吸引了听觉神经元。因此，成熟耳蜗的非感觉细胞有形成新生毛细胞的能力，同时，Math1具有诱导非感觉细胞分化成毛细胞的功能。因此，本发明提供的永生化耳蜗大上皮嵴细胞系中，导入了Math1基因，用来诱导耳蜗大上皮嵴细胞分化成毛细胞。

本发明还提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法，通过病毒载体向耳蜗大上皮嵴细胞中转染SV40大T抗原，然后通过脂质体Lipoofectamine^TM2000介导转入包含Math1基因的质粒prv5-EGFP，G418筛选获得耳蜗大上皮嵴细胞系。

作为优选，上述病毒载体为逆转录病毒载体。

优选地，转染SV40大T抗原的方法为用含有SV40大T抗原的逆转录病毒与大上皮嵴细胞共培养，同时加入EGF(上皮生长因子)及polybrene(聚凝胺)。在两次感染后，换成10％DMEM培养基(加入EGF)培养。利用0.125％胰酶消化作用，将培养物转移至24孔培养板中。通过每日倒置显微镜观察，数天后可以看到感染细胞的克隆，在0.125％胰酶消化作用的同时，利用吸管进行单克隆的提取进而获得细胞的纯化。将提取的细胞单克隆接种至96孔培养板进行增殖和传代。

表皮细胞生长因子(EGF)是一种由53个氨基组成的活性物质，能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。