[发明专利]一种海马抗菌肽hkplp的化学合成方法及其在养殖业中的应用

说明书

技术领域：本发明涉及一种天然抗生素海马抗菌肽hkplp的化学合成方法，特别涉及固相合成海马抗菌肽；本发明还涉及合成的海马抗菌肽在养殖业中的应用。

背景技术：近年来随着抗生素的滥用，抗药菌越来越多，耐药性日益严重，不仅表现在临床上，同时还牵涉到养殖业。据资料显示，在美国临床上分离到的金葡菌有95％对青霉素耐药，50％以上对甲氧西林耐药(Frindkin  SK，Gaynes  RP.Antimicrobial resistance in intensive care units.Clin Chest Med.1999，20(2)：303-316)；20世纪80年代以来，万古霉素耐药菌株也有增长趋势，包括耐万古霉素金黄色葡萄球菌和肠球菌(The centers for Disease Control and Prevention.Staphylococus aureus with reduced sueceptibility to vancomycin-United States 1997.JAMA，1997，278(11)：891-892)。随着人们对环保意识的增强及食品安全级别意识的提高，传统抗生素的滥用导致“超级细菌”的出现，迫切需要绿色环保、安全抗耐药的新一代抗生素取代。

抗菌肽为动物体内免疫防御系统的重要组成部分，是一类小分子肽，被称为无污染的天然抗生素，具有广谱抗菌、无耐药性、热稳定、水溶性好、无毒无残留等优点，符合现代环保的观念。据统计，目前我国尚有多达20种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂，随着我国加入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响我们的家畜产品在国际市场的竞争力。将抗菌肽产品开发成新的代替传统抗生素添加剂的绿色饲料添加剂，将给我国的饲料添加剂行业注入一针强心剂，将整体提升饲料行业的层次，使我国的饲料产品在世界市场更具竞争力，推动我国饲料行业不断向前发展。

我们前期的实验结果表明从海马中克隆得到的两个抗菌肽基因hkplp和hkabf都具有很好的抗菌活性。以HKABF为例，重组HKABF对G⁺菌比较敏感，尤其是对金黄色葡萄球菌，在0.5μg/ml的蛋白浓度即可抑制稀释为约5×10⁶CFU/ml浓度的金黄色葡萄球菌。测试的微生物菌中，其次敏感的为白色葡萄球菌，MIC为2.5μg/ml，再次为华纳葡萄球菌(MIC为5μg/ml)和广州疾控中心分离出的金黄色葡萄球菌III(MIC为5μg/ml)，中山大学附属二院分离鉴定出的金黄色葡萄球菌II(MIC为15μg/ml)，对于摩根氏菌(MIC为30μg/ml)和创伤弧菌(MIC为120μg/ml)这两种G^-菌在较低肽浓度下也能抑制其生长。对于其它G⁺和G^-菌甚至真菌(白色念珠菌、酵母、热带念珠菌)在比较高的蛋白浓度下有的也能显示出不同的抑菌效果。将两个抗菌肽基因hkplp和hkabf同时经毕赤酵母KM71重组表达，检测其抗菌活性表明hkplp的抗菌活性要明显优于HKABF，因此我们选择了抗菌肽基因hkplp人工合成作为抗菌肽饲料添加剂的开发对象。

海马抗菌肽hkplp序列：FLGLIFHGLVHAGKLIHGLIHRNR-NH₂分子式：C₁₂₈H₂₀₅N₄₁O₂₅，分子量MW_[AV]：2718.32，MW_[mon]：2716.6；不含有稀有氨基酸和外源化学成分，在动物消化道中具有良好的稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫且不产生耐药性菌株等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，因此不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。Hkplp可以作为新一代的绿色饲料添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效得解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。

发明内容：本发明的目的在于提供一种海马抗菌肽hkplp的化学合成方法，通过固相合成法人工合成hkplp，解决发酵方法不稳定难大生产的技术问题；本发明的另一个目的是提供合成的海马抗菌肽在饲料添加剂中的应用。

本发明的方法包括如下步骤：