[发明专利]建立非人灵长类动物结核病模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立非人灵长类动物结核病模型的技术方法，更具体地说，本发明涉及一种建立猕猴结核病模型的技术方法。

背景技术

自上世纪80年代以来，由于流动人口增加；艾滋病的迅速蔓延，卡介苗预防效果的有限性以及结核菌多药耐药的出现、传播等因素，使得一度得到较好控制的结核病又死灰复燃，流行趋势呈明显上升，给结核病的预防和治疗带来新的严峻挑战。寻找新的有效抗结核病药物及更为理想的预防性疫苗，成为当今结核研究领域共同关注的重大课题。新型结核疫苗和治疗药物的效果必须通过结核动物模型进行评价。小鼠、豚鼠等小动物结核病模型，用于药物的初筛可起到一定的作用。但因这些小动物结核病模型难以模拟人类结核的疾病过程。而非人灵长类动物与人类亲缘性最近，结构、生理、免疫应答等均与人类近似，其结核病的发病经过、发展规律及临床表现与人类结核病基本相同。因而世界上条件较好国家及地区，均相继开展建立非人灵长类动物(猕猴)结核病模型的研究。国外多用气溶胶、纤维支气管镜法或手术曝露气管将结核菌接种至猕猴肺部而感染动物。但上述方法存在技术要求高，设备复杂，实施成本高的缺点，更重要的是制备的动物模型多为单肺感染，动物感染发病途经与人类自然感染途径存在区别。(W.R.Barclay，1970年；Saverio V.Capuano III，2003年；GERALD P.WALSH，1996年)。国内也有相似方法建立动物模型的报道，但是也同样存在方法复杂，需特殊仪器设备，成本高，难以大规模推广，很难满足大规模疫苗和药物筛选和稳定动物模型的需要。

发明技术内容：

本发明的目的是提供一种建立非人灵长类动物结核病模型的方法，该方法与国外已有的方法相比，无需特殊仪器设备，方法简便，使用成本低，根据动物实验研究要求可制作出用于药物和疫苗评价的非人灵长类感染结核病模型。该方法重复性好，成功率高，动物感染与人类自然感染极其相似。

本发明的另一个目的是提供该方法在制备非人灵长类动物结核病模型中的应用

本发明公开了一种新的建立非人灵长类动物结核病模型的方法，该方法包括下列步骤：

1)选择对非人灵长类动物敏感的结核杆菌；

2)活化结核杆菌，并制备成10-250CFU/毫升浓度的菌悬液；

3)沿非人灵长类动物主气管向肺部方向刺入，以注射方式注入结核杆菌1-5毫升；；

4)在动物生物安全三级实验室内饲养与观察16-48周；

5)判定动物结核病阳性模型。

在本发明中，本发明人有选择性地选用人型结核分枝杆菌H37Rv株，作为对非人灵长类动物敏感的结核杆菌使用，该菌株登录在中国医学微生物菌种目录中，保藏号是CMCC 93009，任何符合研究条件的研究者可通过正常渠道从中国医学微生物菌种保藏中心索取。

在本发明中，本发明人在活化人型结核分枝杆菌H37Rv株后，将菌株制备成10-250CFU/毫升浓度的菌悬液1-5毫升注射入非人灵长类动物，本发明人将菌株制备成50CFU/毫升浓度的菌悬液2毫升注射入非人灵长类动物。

本发明还公开了一种优化的建立非人灵长类动物结核病模型的方法，该方法包括下列步骤：

1)选择人型结核分枝杆菌H37Rv株；

2)活化人型结核分枝杆菌H37Rv株，并制备成50CFU/毫升浓度的菌悬液；

3)用一次性注射器或留置针经皮穿刺气管内滴注法沿非人灵长类动物主气管向肺部方向刺入，注射方式注入结核杆菌2毫升；

4)饲养与观察16-48周；

5)判定动物结核病阳性模型。

在本发明中，本发明人采用经皮气管内穿刺法在实验猴上接种结核分枝杆菌后，实验猴表现食欲降低，咳嗽，甚至嗜睡，体重下降等症状。可检测到抗结核分枝杆菌抗体IgM和IgG，结核抗原刺激PBMC后IFN-γ产生水平明显增加；结核菌素皮肤试验(0T)反应呈阳性，X光检查可见肺部病变，剖检可见双肺结核样病变，并可从肺和胸腔淋巴结中分离大量结核分枝杆菌。动物感染的情况与已前报道的其它感染模型动物的症状类似。