[发明专利]一种利用基因拆分控制转基因飘流的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因生物安全技术领域，具体涉及一种利用基因拆分控制转基因飘流的方法。

背景技术

随着转基因技术的兴起和快速发展，转基因生物的安全性问题相伴而生，由转基因生物引发的安全问题，逐渐成为国际社会广泛关注的热点和焦点。在科技界和公众关注的转基因作物(GMC)安全性问题中，转基因飘流及其可能引起的环境后果和对人类健康的影响是问题的焦点之一。虽然基因飘流历来存在，并非从GMC开始，且是植物物种进化的动力，但遗传上远缘的外源基因在导入到一个新的遗传背景中后会产生何种新的变化，对环境和食品安全性有何影响，需要根据基因的种类、基因所提供的表型性状、以及转基因植物释放的环境等因素进行个案分析。这是一个耗时、费力、需要投入的复杂过程，加之转基因产品要让公众接受，最好的办法是从根本上杜绝基因飘流，保障GMC的环境和食品安全。

目前防止和减少转基因飘流的技术，主要是采取时空隔离(距离隔离、花期隔离)、摘除花器或限制开花、雄性不育等，这些可称为减少基因飘流的现有技术。时空隔离已进行了许多研究，如明确不同作物的最大基因飘流距离，提出相应的距离和花期隔离措施。雄性不育虽可使转基因作物不产生花粉，可有效地用于不需采收种子的植物如林木、牧草、花卉等，但对生产上应用杂交种的作物如杂交水稻而言，该法仍不能避免基因飘流，因为即便用于配制杂交种的父本不产生花粉，但杂种F1在大面积生产中仍将有花粉飘出。因此总体上说，以上现有技术只能限制或减少基因飘流，并不能从根本上解决基因飘流的问题。探索研究用生物学限控措施防止基因飘流的新一代技术，已成为国际研究的热点和前沿课题，它不仅是一项为发展新一代技术的基础研究，而且对进一步促进和推动GMC的产业化具有重要的现实意义。

基因拆分技术是建立在Intein(蛋白内含子)及其介导的蛋白剪接的基础上发展起来的，简单说就是将目的基因拆分成两个基因片段，分别与Intein两个剪接域的基因序列结合，形成融合基因，翻译后形成的两个融合蛋白通过Intein介导的蛋白剪接功能，将Intein从前体蛋白中切除，同时将两个基因片段编码的蛋白序列连接起来，形成一个完整的、有功能的蛋白。

Intein是一类介导翻译后蛋白剪接的内部蛋白元件，前体蛋白中Intein催化一系列反应，将其自身从前体蛋白中移去，并将两侧称为Extein的蛋白片段以正常的肽键连接起来形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接。蛋白剪接是一个非常快速的过程，Intein-Extein连接处的3个保守的氨基酸残基直接参与蛋白的拼接反应，包括Intein N末端的Ser或Cys(基序A的第一个氨基酸)，InteinC末端的Asn或Gln(基序G的最后一个氨基酸)，C-extein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中发现的。1990年Kane等在研究酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡H(+)2ATPase的69kD亚基基因vma1时，首次发现蛋白质的自我剪接现象(Kane PM，Yamashiro CT，Wolczyk DF，Neff N，Goebl M，Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFP1 gene product to the 69-kD subunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase.Science 250：651-657)。Intein普遍存在于三界生物系统(古细菌、真细菌和真核生物)中，目前已发现了200多个(Thomas C，Evans Jr，Xu MQ，Pradhan S(2005)Protein splicing elements and plants：from transgene containment to protein purification.Annu Rev Plant Biol 56：375-392)。Intein一般由128-1650个氨基酸残基所组成，含有高度保守的基序A、B、F和G(Noren CJ，Wang J，Perler FB(2000)Dissecting the chemistry of protein splicing and its applications.Angew Chem Int Ed Engl 39(3)：450-466)。根据Intein是否含有居家核酸内切酶(homing endonuclease)结构域，可将其分为大Intein和小Intein，大Intein含有居家核酸内切酶结构域、N端和C端剪接域，其中居家核酸内切酶结构域不参与蛋白剪接，推测其功能是通过自导引的机制来促进Intein的转移(Gimble FS，Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae.Nature 357：301-306)。另外，根据N端和C端剪接域是否为共价连接，可将Intein分为cis-splicing inteins和trans-splicing inteins(Wu H，Xu MQ，Liu XQ(1998)Protein trans-splicing and functional mini-Inteins of a cyanobacterial DnaB Intein.Biochim Biophys Acta 1387：422-432)。