[发明专利]融合蛋白TETPH、表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及融合蛋白TETPH、表达载体及其构建方法。

背景技术

肺癌，尤其非小细胞肺癌是人类发病率及病死率最高的恶性肿瘤之一，近年来，生物技术给恶性肿瘤的治疗开辟了新途径。

肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis inducing ligand，Trail)基因，1995年，首次由Wiley等(Wiley SR，SchooleyK，Cmolak PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNFfamily that induce apoptosis[J].Immunity，1995，16(6)：673-821.)发现并克隆，Pitti等(Pitti RM，Marsters SA，Ruppert S et al.Induction of apop tosis by Apo-2 ligand，anew member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].J B ioChem，1996，271(22)：12687-90.)于1996年也克隆到同样的基因，而命名为Apo-2L。Trail基因是第3个TNF家族分子，存在于胎盘、肺、肾、脾、外周淋巴等组织的细胞中，在诱导瘤细胞凋亡方面具重要作用。人Trail分子cDNA长1105bp，其分子质量为32.5kD，编码281个氨基酸，等电点为7.63，属II型跨膜蛋白。C端(胞外区)保守性强度与FasL和TNF相当，N端(胞内区)无信号肽，是TNF超家族成员。它的15～40位氨基酸残基为疏水区能形成跨膜结构(Falschlehner C，Schaefer U，Walczak H.Following TRAIL′s path in the immunesystem[J].Immunology，2009，127(2)：145-54.)，天然状态以三聚体方式行使作用。其109位为一N2糖基化位点，金属蛋白酶能将它从膜上切下形成可溶性肽(114～281位氨基酸)，即可溶性Trail(sTrail)。在体外，膜结合型Trail及sTrail都可诱使多种肿瘤细胞凋亡(Ma H，Liu YX，Liu S L，et al 1Recombinant adeno-associated virusmediated TRAIL gene therapy supp resses livermetastatic tumor[J].Int J Cancer，2005，116：314-211.)。  sTrail与其受体结合后启始胞内信号。其受体有二，一是其胞浆结构域不完整或无胞浆结构域，以无功能截断形式存在，与sTrail结合后不传递死亡信号，称诱骗受体(sTrail-R3/DCR1与sTrail-R4/DCR2)；另一是具胞浆死亡结构域，与sTrail结合后，经该死亡结构域激发传递凋亡信号，使Caspase蛋白发生酶解级联反应，使细胞凋亡，称死亡受体(sTrail-R1/DR4与Trail-R2/DR5)。大多数正常细胞表达DCR1、DCR2、DR4、DR5，瘤细胞却仅见DR4与DR5表达，正常细胞的死亡受体与诱骗受体同sTrail竞争性结合，以躲避死亡攻击。肿瘤细胞由于无诱骗受体，易受sTrail攻击而发生凋亡(Zou YX，ZhangXD，Mao Y，et al.Acute toxicity of a single dose DATR，recombinant soluble humanTRAIL mutant，in rodents and crab-eating macaques[J].Hum Exp Toxicol，2010，29(8)：645-52.)。与其它TNF超家族成员相比，sTrail的抗肿瘤作用有如下特点：更强的诱使肿瘤细胞凋亡的能力、广谱的抗肿瘤作用、对正常细胞无显著毒副作用、仅对胞核因子NF-κB有稍微激活作用、与放化疗药明显协同作用等(deBruyn M，Rybczynska AA，Wei Y，et al.Melanoma-associated Chondroitin SulfateProteoglycan(MCSP)-targeted delivery of soluble TRAIL potently inhibits melanomaoutgrowth in vitro and in vivo[J].Mol Cancer.2010，23；9：301.)。sTrail在癌的治疗研究中具旁观者效应(bystander effect)(Ciusani E，Croci D，GelatiM et al.In vitroeffects of topotecan and ionizing radiation on Trail/Apo-L mediated apoptosis inmalignant glioma[J].J N eurooncol，2005，71(1)：19-25.Huang X，Lin T，Gu J，etal.Cell to cell contact required for bystander effect of the TNF-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)gene[J].Int J Oncol，2003，22(6)：1241-45.)，该效应主要依赖转染胞膜表面的结合sTrail与相邻细胞表面的死亡受体结合，显示更强的杀瘤效应。可溶性Trail分子(sTrail)，在体外它能广泛引起许多组织瘤细胞凋亡，对正常细胞却无毒副作用(Wajant H，Gerspach J，Pfizenmaier K.Tumor therapeuticby design：targeting and activation of death recep tors[J].Cytokine Grow th FactorReview，2005，16(1)：55-76.Shi J，ZhengD，Liu Y et al. Overexp ression of soluble Trailinduces apoptosis in human lung adenocarcinoma and inhibits growth o