[发明专利]重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和疫苗领域，具体涉及一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用。

背景技术

Human papillomavirus病毒(HPV)属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤病毒属，是一种嗜上皮细胞的DNA病毒。HPV是宫颈癌的主要致病因子，约99.7％的宫颈癌发病都与HPV感染有关。宫颈癌在全球妇女癌症发病率中居第二位，每年全球大约有50万例。根据致癌性高低，可将HPV分为高危型和低危型两种，其中HPV16属于高危型的代表之一。据统计，大约50％的宫颈癌与HPV16感染相关。宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗、化疗等只对早期患者有一定的疗效，且治疗创伤大，不能防止HPV再度感染。

HPV基因组主要编码2种晚期蛋白(L1和L2)和6种早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)。晚期蛋白为HPV衣壳结构成分，参与病毒颗粒组装。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化。E6和E7基因只存在于癌变组织中，在正常组织中不存在。

树突状细胞(DC)在体内分布广泛，膜表面高表达共刺激分子、粘附分子及主要组织相容性复合物分子，是体内功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始型T细胞的APC，被称为天然“免疫佐剂”，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥等过程中发挥重要作用。它的临床试验结果的一个显著特征就是其安全性，除了发烧、局部反应等，极少有副反应，而且没有见到严重威胁生命的副反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用。

本发明提供的重组腺病毒为表达序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒。

所述蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列1所示。

所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞甲得到的重组腺病毒；所述重组细胞甲是将重组质粒与骨架质粒pBH Glox ΔE1/3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述蛋白质的编码基因得到的重组质粒。

本发明提供的重组腺病毒可有效的感染树突状细胞，使之表达(E6E7融合蛋白)并提呈，注射到体内后可激发HPV16 E6E7特异性的CTL，可用于HPV16感染的宫颈癌的免疫治疗。

本发明还保护所述的重组腺病毒感染树突状细胞得到的重组细胞乙。

所述树突状细胞可为小鼠树突状细胞。所述树突状细胞具体可为用鼠源GM-CSF诱导来自鼠骨髓的CD34+干细胞得到的树突状细胞。

所述的重组细胞乙和/或所述的重组腺病毒在制备宫颈癌预防和/或治疗疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种宫颈癌预防和/或治疗疫苗，它的活性成分是所述的重组细胞乙和/或所述的重组腺病毒。

本发明提供的疫苗可以采用多种方式进行免疫，如采用皮内注射。采用皮内注射时，对于60Kg左右的成年人，建议每月免疫一次，连续免疫六次，每次免疫剂量为2×10⁵个所述的重组细胞乙。

本发明还保护在pDC315质粒的多克隆位点插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒(pDC315-E6E7-1)。

本发明还保护将所述重组质粒(pDC315-E6E7-1)与骨架质粒pBH GloxΔE1/3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞甲。

本发明的优点如下：

(1)选用的抗原是高危HPV16型的两个癌基因E6和E7的融合基因，相比只做单个基因的研究，包含了更多的表位。

(2)包装了表达HPV16E6E7基因的腺病毒，可用来高效感染树突状细胞和其他细胞或直接用来注射人体；相比而言，包装了HPV16 E6E7基因的腺病毒可能是目前最有效的给树突状细胞负载HPV16 E6E7抗原的方法。

(3)目前国内还没有使用腺病毒载体来使树突状细胞负载高危型HPV16抗原的研究，更没有相关的临床研究，本发明使用腺病毒载体使树突状细胞负载HPV16E6E7抗原的细胞疫苗填补国内空白。