[发明专利]新型血管内皮生长因子人源化单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及抗体药物开发和生产技术领域。具体地，本发明涉及获得人血管内皮生长因子(hVEGF)不同表位的鼠单克隆抗体。同时，本发明还涉及单克隆抗体的人源化及其表达制备方法。

背景技术

血管生成系统在许多疾病发展过程发挥着重要作用，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣(Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physio1.53：217-239，1991；Folkman J.J.Bio1.Chem.267：10931-10934，1992；和Garner A，Vascular Disease In：Pathobiology of ocular disease.Adynamic approach.Garner A，Klintworth GK编，2版，Macel Dekker，NY，pp1625-1710，1994)。多数实体肿瘤生长是血管依赖性的，如果没有丰富血液供应氧气和营养物质，原发肿瘤不会超过2-3mm³(Folkman J.N Engl J Med.，285：1182-1186，1971，Folkman J.N Engl J Med.，333，1757-17631995)。

血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅和VEGF₁₆₅是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。

使用抗体靶向肿瘤特异抗原可以用来治疗肿瘤。鼠移植动物模型鉴定肿瘤抗原分为两种：一种是肿瘤特异移植抗原；一种是肿瘤相关移植抗原。肿瘤特异移植抗原是指肿瘤中突变基因编码的蛋白，经过I型MHC被展示到细胞表面。人基因组单个细胞的恶性转化诱因包括化学诱因、放射性诱因和病毒诱因等。在基因组水平，这体现为病毒癌基因、细胞原癌基因、抑癌基因等癌症相关基因的突变。癌症相关基因功能多与细胞复制调控和细胞死亡调控直接相关。诱导细胞复制的原癌基因有编码生长因子和生长因子受体的，例如sis编码一种血小板来源生长因子，fms、erbB和neu编码生长因子受体；有编码信号传导通路和转录因子的，例如src编码酪氨酸激酶，ras编码GTP结合蛋白，myc、jun和fos等编码转录因子。抑癌基因能够抑制过度细胞复制，例如Rb基因突变导致retinoblastoma，p53蛋白编码一个核磷酸蛋白。大部分癌症诱导和发展过程是多步骤的。例如人直肠癌发展过程表现出稳定的不同时期特征和依次经历系列的遗传突变。不能有效免疫激活和/或免疫耐受可能是肿瘤晚期无法控制的原因，临床表现为恶性肿瘤形成和原发肿瘤临近淋巴结的肿大。肿瘤相关移植抗原包括肿瘤发展必须蛋白、细胞有丝分裂特异蛋白、肿瘤细胞组织特异性蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的血管内皮生长因子，是恶性肿瘤组织新血管生成所必须的(Folkman等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)285：1182-1186(1971))。原位杂交研究表明，许多肿瘤VEGF是过度表达的，包括：肺癌、乳腺癌、肾癌、和子宫癌等(M.Volm等人，Int.J.Cancer 74：64-68，1997；H.Yoshiji，Cancer Res.56：2013-2016，1996；M.Tomisawa，Eur.J.Cancer 35：133-137，1999；H.M.Sowter，Lab.Invest 77：607-614，1997)。Genentech公司生产的VEGF人源抗体Bevacizumab对非小细胞肺癌、直肠癌和乳腺癌均有疗效，其药理是体内注射VEGF抗体特异阻断VEGF的促新血管生成功能，从而抑制恶性肿瘤生长速度。