[发明专利]一种紫花野菊高效再生体系建立的方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，专用于紫花野菊基因工程和转基因育种工作，属于菊花生物技术育种领域。

二、背景技术

紫花野菊(Chrysanthemum zawadskii)，又名山菊(东北植物检索表)，为菊科菊属的植物。分布在蒙古、俄罗斯、欧洲以及中国大陆的河北、甘肃、山西、吉林、黑龙江、安徽、陕西、内蒙古、辽宁等地，生长于海拔850米至1,800米的地区，多生于草原、林间草地、林下及溪边，目前已由人工引种栽培。

本课题组前期研究建立了菊花耐涝评价体系，并对57个菊花近缘种属植物进行了耐涝性鉴定，结果发现，菊花近缘种属植物的耐涝性遗传背景差异十分明显，筛选出紫花野菊等8份耐涝材料，是一批宝贵的耐源材料，可用于菊花耐涝育种。植物的耐涝性是一个受多种因素制约的复杂问题，不同野生物种、同一野生种不同地理居群在同样水涝环境中存在耐涝性强、弱差异，可能与在不同原生境下，形成耐涝力不同的基因型有关，当淹水厌氧信号出现时，与形态、结构和生理变化相关的基因被诱导激活而表达，以获得耐涝性。在发掘出耐涝优异资源的基础上，还需要进一步研究其耐涝的形态、解剖、生理、生化、遗传与分子调控机制，以揭示菊花的耐涝机理，并推动耐涝菊花新品种选育。

紫花野菊的再生体系研究至今未见报道，因此，系统深入研究其再生能力及获得再生植株，建立专门针对紫花野菊的高效稳定的再生体系，可为菊花耐涝基因工程和转基因育种工作提供理论基础和实验依据，将有效推进高等植物抗性生物技术育种进程。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是建立了一套适用于紫花野菊的高效稳定的再生体系，专门对紫花野菊的再生能力进行了系统深入研究，为菊花基因工程和转基因育种奠定基础。

技术方案

本发明是一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，其实施方案如下：

1、建立紫花野菊高频再生体系的方法，包括：

1)无菌苗的获得

于秋末取紫花野菊脚芽，洗涤剂清洗10-15min，流水冲洗1-2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用70％乙醇浸泡30s，0.1％升汞溶液消毒7-9min，无菌水冲洗3～5次，切取0.5cm-1.0cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1的培养基上诱导腋芽萌发，待不定芽长至1-2cm时切下转入1/2MS的生根培养基上获得无菌苗；

2)再生体系的建立

1)叶片最适分化培养基的选择

筛选诱导分化培养基时，将叶圆片分别接种于含有细胞分裂素6-BA 1.0、2.0或3.0mg·L^-1和生长素NAA0.1、0.5或1.0mg·L^-1的MS培养基中，每瓶接种8个叶盘，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次。观察并记录不同培养基上愈伤组织形成和不定芽分化情况；30d后统计再生率和平均芽数；培养基中含蔗糖3％、琼脂0.7％，pH为5.8。

不定芽再生率(％)＝再生不定芽的外植体总数/接种外植体总数×100％；

平均芽数＝外植体再生不定芽总数/再生不定芽的外植总数

2)叶片发育程度对分化的影响

分别取25d苗龄的无菌苗顶端幼叶和近基部成熟叶切成5mm²大小，接种于叶片最适分化培养基上，30d后统计再生率和平均芽数。观察对比其愈伤组织褐变及不定芽再生情况。

3)不定芽生根情况

叶片诱导产生愈伤组织后，继代培养后转入1/2MS生根培养基中进行生根培养，获得完整植株。观察并记录生根情况。

生根率(％)＝不定芽生根株数/接种不定芽总数×100％

有益效果

本发明提供的一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

1.本发明首次针对紫花野菊再生能力进行了系统深入的研究，为后续的紫花野菊耐涝基因工程和转基因育种工作提供了最基本的方法。

2.在再生体系建立中，利用两种激素(细胞分裂素6-BA、生长素NAA)随机区组设计筛选出最佳诱导分化培养基(MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1)；在比较近基部成熟叶和顶端幼嫩叶叶片分化情况时发现，与近基部成熟叶片相比，顶端幼嫩叶片愈伤组织不易褐化，且提高了再生率；不定芽生根培养基以不加激素的1/2MS生根培养基生根效果最优，且生根率为100％。