[发明专利]二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示

说明书

背景技术

优先权申请

本申请要求于2009年11月17日提交的美国申请No.61/261,767的优先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本发明涉及用于产生pIX噬菌体展示文库及使用该文库来制备二聚体抗体片段、完整抗体或其它二硫键连接的多聚构建体的组合物和方法。

关于本领域的讨论

丝状噬菌体展示是一种广泛使用的基于亲和力选择蛋白质的技术，因为在选择过程中每个噬菌体颗粒将编码多肽的核酸与其外壳蛋白的N端融合连接在一起。M13噬菌体编码五种外壳蛋白，在噬菌体的一端具有大概五个拷贝的次要外壳蛋白pIII和pVI，在噬菌体的另一端具有相同数目的pVII和pIX。噬菌体DNA由大概3000个拷贝的主要外壳蛋白pVIII包封。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pIII和pVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用该技术，已构建了肽、Fab、scFv和其他蛋白结合物(protein binder)的文库并且可用于各种应用，具有极大商业价值。

pIII外壳蛋白由于其大小、构象和低拷贝数而较pVIII蛋白更受欢迎。pIII次要外壳蛋白是负责噬菌体感染进大肠杆菌中的404个氨基酸、42kD的蛋白质，其包括由柔性铰链区段连接的三个结构域。与pIII的N端融合可系住离开噬菌体表面的所展示的蛋白质，从而与融合至小的高拷贝数的pVIII外壳蛋白相比配体更有可能接近进行结合。pIII蛋白是感染和融合的初始步骤所必需的，除了小的肽和蛋白质之外所有肽和蛋白质可干扰该过程。该问题例如通过使用含有另一拷贝的野生型pIII蛋白的病毒载体或采用辅助噬菌体的噬菌粒系统来解决。与pIII和类似的pVIII形成对比，pVII和pIX是分别为33个和32个氨基酸的短螺旋蛋白质，在噬菌体表面紧密包装。然而，已在pIX上展示了scFv(Gao，C.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 99，12612-12616，2002)和Fab(Shi，L等人，J Mol Biol 397，385-396，2010；Tornetta，M等人，J Immunol Meth 360，39-46，2010)文库并进行了选择。已通过将不同的多肽与pVII和紧密相邻的pIX二者融合描述了Fv和肽的异型二聚体展示(Gao等人，1999Proc Nat Acad Sci 96：6025-6030和Janda US7078166)。此外，已报道了单一特异性scFv的pVII展示(Kwasnikowski等人，2005.J Immunol Methods 307：135)。也已描述了一种备选的方法，在该方法中由噬菌体或噬菌粒载体编码的外源蛋白(exoprotein)不与外壳蛋白融合，而是通过二硫键键合共价连接至重新工程改造的外壳蛋白pIII和pIX(US6753136)。

在噬菌体颗粒的表面上展示二聚体蛋白质以及异型二聚体蛋白质的能力在以组合文库形式模拟更复杂的蛋白质结构方面是有利的。一直需要推进现有技术来产生筛选复杂蛋白质的变体的高通量方法，复杂蛋白质的变体为例如人IgG的变体，人IgG为通过分子间的二硫键连接的重链和轻链对(异型二聚体)的同型二聚体。至今，还不可能演示完整的抗体重链在丝状噬菌体上的正确装配和展示。本发明的文库和方法通过将全面的设计、装配技术以及噬菌体pIX Fab展示相结合来满足这些需要。

发明内容

本发明提供了利用M13外壳蛋白pIX在丝状噬菌体上展示二硫键连接的二聚体蛋白质以及更复杂结构的容易手段。在本发明中，所展示的蛋白质为融合蛋白，其包含pIX外壳蛋白、折叠的结构域如CH2结构域，这两个结构域连接至包含半胱氨酸残基的多聚体化结构域，如铰链结构域。在一个特定的实施例中，该二聚体蛋白质是同型二聚体，其中成员是二硫键连接的，并且该蛋白质包含抗体Fc。在另一个实施例中，该二硫键连接的同型二聚体蛋白质包含人抗体蛋白质，其中至少铰链结构域和恒定结构域存在于包含该同型二聚体的多肽的每一者中，并且任选地，该同型二聚体结构还通过形成二硫键与独立表达的抗体轻链联合(associate)。