[发明专利]转基因植物细胞的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及在染色体上的特定靶DNA部位引入了突变的植物细胞的制造方法。更详细地说，涉及：在介由通过限制性内切核酸酶的DNA双链断裂和非同源末端接合，制造在染色体上的靶DNA部位引入了突变的植物细胞的方法中，利用参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能被抑制了的植物细胞的方法。

背景技术

植物生物技术的主要焦点是作物的遗传修饰及改良。为了该目的，对于作为模型植物的拟南芥属、和/或包含稻属、玉米属、小麦属、大豆属及番茄的很多作物中，已完成大规模的基因组分析。由此可利用庞大量的基因组序列信息，以该序列信息为基础，开发能够直接改变高等植物的基因组上的目标基因的方法的必要性提高。但是，到目前为止，尚未开发出有效且通用性高的方法。

最广泛使用的定点诱变策略，是利用同源重组的基因打靶。有效的基因打靶法在酵母(非专利文献1)、小鼠(非专利文献2)中已经利用了20年以上。进而，在拟南芥属或稻属中也已进行基因打靶(非专利文献3～6)。基因打靶现象，典型地在被处理的细胞中以较少的比例发生(在酵母中每细胞10^-6～10^-2的基因打靶现象，在小鼠ES细胞中每细胞10^-7～10^-5的基因打靶现象)。在高等植物中，每细胞的基因打靶效率极低(每细胞小于10^-7的基因打靶现象)(非专利文献3、7～11)。

认为高等植物的这样低的基因打靶频率是由用于修复DNA双链断裂的、同源重组与非同源末端接合(NHEJ)的竞争而产生的，考虑主要的双链断裂的修复途径是非同源末端接合(非专利文献12、13)。作为其结果，在供体分子的末端，与同源重组相比，非同源末端接合更参与该过程，因而基因打靶效率减少。根据大范围的数据，启示高等植物中通过非同源末端接合的双链断裂的修复容易产生差错。双链断裂往往通过伴随插入和/或缺失的非同源末端接合过程而被修复(非专利文献14、15)。如果合并考虑这些观察结果，则启示：基于用于高等植物中的靶向化诱变的非同源末端接合的策略，与基于同源重组的策略相比是有效的。实际显示，在染色体上以低频率产生断裂的限制性酶I-SceI的表达，在拟南芥属、烟草属中诱导I-SceI的切割部位的突变(非专利文献16)。尽管如此，但可利用该酶的限于很少产生的天然识别部位或人工靶部位。

为了克服该问题，已开发出锌指核酸酶(ZFNs)。锌指核酸酶是由以锌指为基础的人工结合结构域和DNA切割结构域构成的嵌合蛋白质。对于锌指核酸酶，通过修饰其DNA结合部位，可特别设计成事实上能切割任何长度的双链DNA序列那样(非专利文献17、18)。

基于非同源末端接合的靶向化诱变的策略，最近通过将人工的锌指核酸酶用于产生特定基因组位点的双链断裂而在几种生物中得到发展(非专利文献19～23)。通过利用非同源末端接合的双链断裂的修复，从而屡次在结合部位产生缺失和/或插入。2组使用锌指核酸酶，在斑马鱼的胚中成功地使基因进行遗传性突变。特异的锌指结构基序已设计成识别可区别的DNA序列那样(非专利文献19、20)。将编码锌指核酸酶的mRNA导入单细胞期胚中，从而高比例的动物保持所需的突变和表型。由这些研究证实，如果利用锌指核酸酶，则可特异且有效地在生殖系列中所需的座位制作出遗传性突变，而且通过该锌指核酸酶诱导的等位基因被传播至后代。

Lloyd等(非专利文献21)，在拟南芥属中，为了定点诱变而使用了锌指核酸酶。并且报告，如预期的那样，通过诱导锌指核酸酶表达，在后代幼植物中，染色体上的识别部位以7.9％的频率产生突变。但是，在该报告中，使用了以下模型系，所述模型系使用以往所报告的对于3指型的ZFN-QQR(非专利文献24)的人工靶部位。因此，对于在拟南芥属中内源性基因的靶部位，锌指核酸酶是否有效地产生断裂、诱发突变，尚不明确。另外，最近报告了在玉米属和烟草属中可通过锌指核酸酶在内源性的基因的靶部位进行诱变(非专利文献25、26)，但关于改善突变引入效率的可能性没有报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2005-237316号公报

非专利文献

非专利文献1：Rothstein R Methods Enzymol 194：281-301，1991

非专利文献2：Capecci MR Science 244：1288-1292，1989